双苯咪唑类的Hochest-33342和33258及 JC-1染色
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双苯咪唑类的Hochest-33342和33258及 JC-1染色
双苯咪唑类的Hochest-33342和33258
该染料可渗透细胞 膜进入细胞内，与DNA结合，使之染色。凋亡细胞对该染料的摄取增高，染色后呈强蓝色荧光。其实验方法如下。
(1)细胞培养及凋亡的诱导：将细胞接种在10cm的培养皿中(106 细胞)，在适当的时机诱导细胞凋亡。
(2)收集细胞：悬浮生长的细胞可直接离心收集(1 000r/min，5min)。对于贴壁生长的细胞可以先收集细胞培养液(可能含有因凋亡而悬浮的细胞)，再用胰酶消化贴壁细胞，然后将两者合并，离心收集细胞并用1×PBS洗细胞沉淀物。
(3)固定：细胞沉淀物悬浮在300ul甲醛(4％)中固定30min，然后经PBS洗涤后离心收获细胞。
(4)染色：细胞在100ul Hoechst-33342(sigma)中染色10min，然后将细胞悬液滴在载片上，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察并拍照片。
JC-1染色
JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization)，其外膜为负极，内膜为正极。电位差由Ca2+ 、Na+ 和H+ 流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化(depolarization)时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane potential)，而与线粒体的形态、体积和密度都无关，因而能更好地反映线粒体的功能状态。由于凋亡发生的早期存在线粒体的去极性，因此，JC-1染色被用于检测凋亡的早期发生。其实验方法如下。
JC-l染色非常简单。首先可将成品JC-1以DMSO配成储存液(1～5mg/ml)，储存于-20℃，用时以培养液稀释至10ug/ml终浓度。对贴壁细胞可以直接弃去培养液，漂洗细胞后直接加入染色液，10-30min后在荧光显微镜下或者激光共聚焦下观察。线粒体状态好时细胞以绿色为主，当红光信号增强时，红绿相叠，以橙色为主。该染色运用于悬浮细胞时还可以通过流式细胞仪进行检测，收集红/绿信号强度，计算其强度比。
