蛋白质组学研究策略
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蛋白质组学研究策略
与基因组学相比，蛋白质组学的技术平台尚不完善，需不断优化和完善现有的平台，并建立与发展新的平台。目前尚没有合适的方法能一步实现对复杂蛋白质混合物的定性和定量分析，还必须把分离、鉴定、定量以及数据处理手段进行整合。文献报道的蛋白质组学研究策略多种多样，但是主要有两种路线：第一种是传统的二维凝胶电泳分离、胶内酶解与质谱技术鉴定相结合的方法，这也是目前最常用的一种路线；第二种方法先将混合蛋白酶解，经过适当的色谱分离手段之后，对肽段进行质谱分析，并据此实现蛋白质的鉴定。如果需要进行定量比较，可以对蛋白质或肽段进行稳定同位素标记或亲和标记。
第一种路线已有25年的发展历史。蛋白质通过二维凝胶电泳进行分离，染色后用蛋白凝胶成像系统将凝胶成像并进行分析，初步发现表达量有差异的蛋白质点。然后可以将感兴趣的蛋白质切下、酶解后用质谱技术鉴定。采用该路线进行的研究结果表明，不论研究体系如何，许多鉴定的蛋白质都是相同的，这说明该方法的动态范围有限。对酵母蛋白质组的系统研究也发现该方法通常只能看到高丰度的蛋白质。这可能是该路线所面临的最大问题，因此二维凝胶电泳技术也在不断的发展和完善中，包括二维凝胶电泳分离前样品的预处理、开发更灵敏的染色方法以及更高分辨率的分离胶等。
第二种路线是最近几年发展起来的，其起源可追溯到1992年，Hunt及其同事首先用LC―MS／MS的方法对蛋白复合物进行了研究。当时他们所用方法用于蛋白质组学的定性和定量研究还有很多困难：首先，对于复杂的蛋白质体系，酶解之后的肽段数目极多，一维色谱的峰容量不足；第二，无论是MALDI―MS还是ESI―MS，都不是理想的定量检测器；第三，对于实验产生的大量数据，需要有相应的处理和分析手段。近年来多维色谱分析技术如二维和三维色谱分离体系的出现使该技术平台不断得到发展。理论上该方法路线可以检测到丰度较低的蛋白质。
稳定同位素标记法和同位素标记亲和标签法(isotope codedaffinitytags，ICAT)的运用可以更好地定量分析微量蛋白质。稳定同位素标记法的原理是：对化学性质完全相同而被标记不同重量同位素的被分析物在质谱中可以很容易地被分辨出来，它们的相对定量可以通过比较其质谱信号强度来精确计算。同位素标记可以通过蛋白酶解过程进行18 O标记，也可以通过化学反应标记，或以新发展的稳定同位素氨基酸标记。该方法通过代谢标记在细胞培养过程中完成，避免了化学反应步骤，而且可以与后续的分离手段兼容。
美国应用生物系统公司最新推出了基于MALDI―TOF和LC／MS／MS进行定量的ICAT技术，可以定量分析两种不同组织或细胞(如正常与肿瘤组织、用药前与用药后组织细胞内)蛋白质组表达的差异，并对差异蛋白质进行结构鉴定。其机制和过程如下：分别用DO和D8试剂与同种细胞的不同形态(女[1ie常细胞和病变细胞)中的所有蛋白质反应(如DO与正常细胞、D8与病变细胞)，试剂选择性与半胱氨酸反应，然后把两种反应产物混合在一起进行酶解，用亲和色谱分离被标记的肽段，进行MALDI―TOF或LC／MS／MS测定。如一对峰相差8个质量数，则为同一种蛋白质，由DO和D8峰的相对强度进行相对定量。
ICAT技术的优点是：①可用于从微量组织、细胞或体液中提取的蛋白质的定量分析；②可以兼容各种生物化学或物理分级分离，因而可用于低丰度蛋白质的定量分析；③易于自动化，实验样品制备不需要二维凝胶电泳分离。
