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尘螨重组变应原表达与合成

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尘螨重组变应原表达与合成
 
    DNA 重组技术提供了借助与载体系统合成尘螨变应原及多肽的可能性。对于完整以及大片段的多肽变应原来说,表达系统是十分重要的。激活T细胞的蛋白质仅需要一级结构,而刺激B细胞表位并能与抗体结合者需三级结构。从以往的实验来看,表达的重组变应原仅能满足于T细胞的研究。由于尘螨1~3类变应原是诱发哮喘的重要组分,与患者血清IgE的结合率几乎达到100%,目前研究的重点主要集中在这些变应原上。
 
    DNA重组技术通过载体表达尘螨性变应原与多肽,以期获得大量的特异性成分,对于研究及治疗大有裨益。
 
    1.细菌表达
    通过IgE免疫试验从含有Der p2的cDNA库选出阳性的lambdagtll噬菌体克隆,该载体表达重组2类变应原的抗原性很高,但得量较少。pGEx载体可以表达高剂量的重组蛋白,如每升培养液可分离0.3mg之多。重组的Der p2与IgE的反应性与天然蛋白质差别不明显。户尘螨和粉尘螨的重组蛋白可变环上特异性表位的差异极为显著,虽然该重组蛋白用与抗血清能够发生反应,但不理想。在所有细菌表达试验中,重组的成熟蛋白、多肽与cDNA编码无关的前酶或酶原前体均分别含有一个额外的108和80N末端残基。
 
    2.酵母表达
    首先构建pYELCS载体结合酿酒酵母中的铜离子敏感金属-硫蛋白基因启动子的表达系统。该系统可以表达少量的Der p2融合蛋白,得量为0.5mg/L,重组Der p2可被单克隆抗体柱层析。因得量少,并且表达的融合蛋白含有较多的非溶性Derp2,限制了与IgE的结合率。完整的Derpl在这个系统中却有很高的得量(40mg/1),均为非溶性蛋白,也可被单克隆抗体柱层析,重新还原的产物可以被抗Derpl血清识别,其结合率优于pGEX克隆产物。为了减少繁琐,表达更好的重组蛋白,有人尝试以Der p1的原酶和酶原放人同一酵母载体表达,效果良好。
 
   3.哺乳动物表达
    构建一个扩大的载体PEE6.HCMV.GS,从中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达Derpl和Derp2。人巨细胞病毒(CMV)启动子(ACMD)和谷胱甘肽合成酶基因,通过放大质粒拷贝数增加细胞内酶高效表达,以控制抗代谢产物硫代甲硫氨酸(methionine sulphoximine,MSX)。粗略估计,106 细胞的裂解产物可获得Derp2可溶性蛋白10ug。
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