免疫组织化学抗体的稀释度、滴加与操存
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免疫组织化学抗体的稀释度、滴加与操存
《一》实验计划
每次实验前应列出详细实验计划，其中包括实验目的、拟用方法、所用一抗和二抗的种类和效价、预实施的操作流程方案以及预期实验结果等。实验分组编号用玻璃笔标记在玻片上，对每一抗体均应配以阳性和阴性对照。
《二》抗体的稀释度
抗体
稀释度，即抗体浓度。组织中抗原的免疫染色是通过适宜的抗体溶液系统而得以定性和定位，因而抗原与抗体浓度的比例十分重要。最佳的抗体稀释度可提高染色质量，与周围组织或细胞形成良好的染色对比。如果抗体浓度过高，反而减少抗体与抗原的结合，甚至导致假阴性结果，故各实验室每当使用一种新抗体时，必须试用多种稀释度，从中确定最佳工作浓度，以防假阴性结果的出现。由于标本的固定、切片种类、稀释液种类和湿盒等具体条件均可影响稀释度，故在测试之前必须使这些条件稳定。稀释度应选择阳性反应着色最强、背景着色最弱的滴度。
不同浓度BMP4对ChAT阳性免疫反应细胞数量的影响
目前，许多实验室常用浓缩型一抗，使用前稀释成工作浓度的稀释方法见。由于市售的常用二抗，即生物素化IgG，一般由试剂公司配成即用型，并装入免疫组织化学试剂盒内，故不必测试二抗工作浓度。
确定一抗最佳工作浓度方法
从中可以看出，在一抗稀释度1：100和1：200之间可找出最佳稀释度。
《三)滴加抗体注意事项
切片在血清封闭后，倾去多余血清，便可滴加第一抗体。滴加前取出玻片，用吸水纸拭去组织周围的液体，组织与细胞表面的液体要用滤纸条轻轻吸掉，但注意勿使组织干燥，尽快滴加抗体工作液1滴(约50ul)于组织表面。由于切片周围无液体，滴加的抗体成为一个液滴，这样既可节省抗体，又可增加抗原与抗体结合的机会。如果玻片上是培养细胞，应在镜下选择一个理想的区域用免疫组织化学油笔在此区域外围画一圆圈，再滴加抗体，尔后应轻轻摇动切片数秒，以促进抗体与组织待测抗原的结合，避免假阴性小区的出现。这一操作过程虽然简单，却十分重要。加抗体时切忌加样器或吸头碰到组织或细胞，以免造成破损。
《四》抗体的操存
1．抗体分装购人的浓缩型抗体，为避免反复冻融而失效，一般需要分装在多个安瓿中，根据需要量，每安瓿含10一20rA。除留一支现用，其余应立即放置低温冰箱内贮存(-20℃以下)。用时取一支。以免长期保存在4℃冰箱内失效。
2．抗体稀释一般按其工作浓度稀释，如1：100、1：1000等，然后用旋涡器混匀液体。剩余的抗体可保存在斗℃冰箱内．尽量在1―2个月内用完，而不要放在0℃以下。否则抗体会很快结冰，反复冻融可使抗体效价急剧下降。对于抗体的稀释液，在夏天温度很高时，最好加入少许防腐剂如叠氮钠或柳硫汞等，以免在切片上作用时间超过10小时而生真菌。
3．无菌与消毒保持使用中的抗体无菌是困难的，但是与抗体接触的工具如滴管、吸管、试管、安瓿以及加样器等最好经过消毒，尽量减少污染的机会．否则抗体极易污染细菌与真菌，从而迅速发生浑浊沉淀而失效。
