DEAE membrane吸附法分离与纯化DNA片段

利用离子交换的原理，在低盐情况下使DNA 吸附在带正电荷的滤膜上，再利用含有高浓度盐类的缓冲液将DNA 自膜上溶离下来。

仪器用具：Mupid II 迷你电泳槽；UV transilluminator;防护面罩；扁平药匙；干净刀片；65℃水浴或恒温槽

药品试剂：

经BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31

含EtBr 的1.0 % 12-well agarose gel

1×NET （20 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 0.1 mM EDTA, pH 8.0）

High salt NET （20 mM Tris-HCl; 1.0 M NaCl; 0.1 mM EDTA, pH 8.0）

0.5 M NaOH；10 mM EDTA;TE-8.0;n-Butanol

Phenol/chloroform/isoamyl alcohol （PCI, 25:24:1）

Chloroform/isoamyl alcohol （CI, 24:1）

10 M ammonium acetate （NH4OAc）

DEAE membrane （Schleicher & Schuell, NA 45）

过滤膜 （Millipore VSWP 01300, 0.025 μm, 13 mm）

方法步骤：

1） 经BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31,置65℃水浴10 min,移至冰浴降温后，以含EtBr 的1.0% agarose gel 进行电泳。

2） NA 45 以灭过菌的剪刀剪成适当大小，置于培养皿中，以10 mM EDTA-8.0浸泡处理10 min,继以0.5 M NaOH 处理5 min. 以无菌水快速清洗五、六次后，浸泡于无菌水中，置于4℃可保存数周。

3） 电泳后的胶片以EtBr 染色后，以长波长UV 灯观察DNA 片段所在位置，并在DNA 色带前后切一刀，以扁平药匙辅助将NA 45 插入DNA 前后的切缝中；再以UV 灯观察NA 45 插入的位置是否恰当。

4） 将胶片置回电泳槽中，以100 V 进行电泳约10 min （时间随NA 45 位置与DNA 距离而定）；以UV 灯观察DNA 是否完全吸附到NA 45.

5） 将NA 45 取出，浸于NET中漂洗以去除附着于NA 45 的胶体 （可用微量移液器头末端将胶体轻轻去除），再移置于微量离心管中 （每2~3 片置于一管中），吸去多余的液体。

◆ 注意！ 不可让NA 45 干掉，否则DNA无法被溶离下来。

6） 加入0.3 mL high salt NET,于68℃加热40 min,其间不时震荡。

◆ NA 45 膜片避免重迭在一起，并且必须完全浸泡于溶液中。

7） 将溶液吸出，原管中的NA 45 再加入300 μL high salt NET,于68℃加热10min.

◆ 以下的步骤常容易出错，请务必分清楚离心后该取上层或下层溶液，请先保留各部份的溶液，确定无误后再丢弃。

8） 将两次溶离液合并，加入等体积的n-butanol,震荡混合，以12,000 rpm 离心5 min.离心后应可分为两层，DNA 溶液在下层。仔细观察管底是否有沉淀，吸取下层溶液至另一离心管，避免吸到沉淀。 这时DNA 溶液体积应该减少，可以把两管或三管的溶液合并成一管。

◆ 溶离后的NA 45 请以UV 照射检查是否仍有DNA 残留。

9） 加入等体积的PCI,震荡混合，以12,000 rpm 离心5 min.

10） 吸取上层水溶液至另一离心管，原管中加入等体积的TE-8.0,混合均匀，以12,000 rpm 离心2 min.将上层液吸出。

11） 合并上层液，加入等体积CI,震荡混合，以12,000 rpm 离心2 min.

12） 将上层溶液吸出，加入0.2 倍体积的10 M NH4OAc,2.5 倍体积的绝对酒精，置 -20℃沉淀至少 30 min.

13） 以12,000 rpm离心20 min （4℃），沉淀以 -20℃预冷的70%酒精洗两次，以同转速离心2 min.

◆ 倒掉上清时请小心，不要让沉淀流失！ 沉淀通常很少，且因纯度高，沈淀几近透明，不易察看；上清最好吸到另一微量试管中暂时保留。

14） 沉淀干燥后溶于20 μL TE-8.0 中。

15） 取一个直径3 cm 的培养皿，加入5 mL TE-8.0.以平端镊子小心夹取VSWP滤膜，将滤膜的光亮面朝上置于液面上。 将溶离的DNA 溶液加在膜上，静置透析至少30 min 以去除残留的盐。