Silica gel吸附法分离与纯化DNA片段

药品试剂：

经BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31

含EtBr 的1.2% 12-well agarose gel

1×TAE 电泳缓冲液

QIAquick Gel Extraction Kit （Qiagen），内含：

QIAquick spin column （管柱底部为silica gel membrane）

Buffer QG

Buffer PE

Buffer EB （10 mM Tris-HCl, pH 8.5）

2 mL 收集管

TE-8.0

方法步骤：

1） 经BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31,置于65℃水浴10 min，移至冰浴降温后，以含EtBr 的1.0% agarose gel 进行电泳 （两种样品各用六个wells,每个well 注入30 μL 样品）。

2） 电泳后以长波长UV 灯观察DNA 片段所在位置，并以干净刀片将GUS 及pQE31 片段切下，请尽可能去除周围多余的胶体。

3） 取数个微量离心管，分别称重并记录重量后，将胶体置于管中再称重，估计胶体重量。

◆ 注意！ 每管胶体不可超过400 mg.

4） 于离心管中加入Buffer QG,加入比例为： 每100 mg 胶体加入0.4 mL BufferQG.

◆ Buffer QG 中含有guanidine hydrochloride,会对皮肤及眼睛造成伤害，请小心使用。

5） 置50℃水浴中15 min,每隔 2~3 min 以手指轻弹管壁促进胶体溶解。如果胶体尚未溶解完全，则延长5~10 min,务使胶体完全溶解。

6） 待胶体完全溶解后，检查溶液颜色是否为黄色 （应与Buffer QG 相近），若颜色为橘色或紫色，表示pH 值不恰当，请加入10 μL NaOAc （3 M, pH 5.0），混合均匀后，再检查溶液的颜色。

◆ 胶体溶液的pH 值必须≦7.5,若大于7.5,会造成DNA 与silica-gelmembrane 间的吸附效率骤降。此组套的Buffer QG 中含有pH 指示剂，若pH≦7.5,溶液颜色应呈黄色。

7） 将spin column 置于2 mL 收集管中，加入上述完全溶解的胶体溶液，以12,000rpm 离心1 min.

◆ 每个QIAquick spin column 只能装约0.8 mL 溶液，所以请分多次离心，每次离心完需将下方收集管内的收集液倒掉。

◆ 若 DNA 片段小于500 bp 或大于4 kb,可于胶体溶液中加入1 倍体积的isopropanol,混合均匀后，再加入spin column 中离心，以提高DNA 回收效率。

8） 将spin column 置回收集管上，加入0.5 mL Buffer QG,再以12,000 rpm 离心1 min,以去除残存的agarose 胶体。

9） 离心后，倒掉收集管中的溶液。将spin column 置回收集管上，在spin column中加入0.75 mL Buffer PE,于室温静置2~5 min 后，以12,000 rpm 离心1 min,并去除收集管中的溶液。

10） 将spin column 置回收集管中，再于13,000 rpm 离心1 min,以完全去除spincolumn 中残留的Buffer PE

◆ Buffer PE 中含有酒精，必须完全去除，否则易干扰后续酶反应。

11） 将spin column 置于干净的1.5 mL 微量离心管中。将30 μL 溶离缓冲液（Buffer EB） 加在silica membrane 上，静置1~5 min,以将吸附于膜上的DNA完全溶离出。

◆ 溶离缓冲液的pH 值需在7.0~8.5 间，才能达到最佳溶离效果。也可以用TE-8.0 或水作为溶离液，但使用TE-8.0 时，需考虑EDTA 是否对后续的实验有影响；使用水进行溶离时，则需注意水的pH 值，及溶离DNA 的保存 （DNA 在水中并不不稳定）。

12） 以12,000 rpm 离心2 min.收集微量离心管中含有DNA 的溶离液，并进行DNA 的定量及接合反应。