Histochemical detection重组质体的检定
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操作原理与colony hybridization 相同,但是将滤膜移置于含有IPTG 及5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide (X-Gluc) 的培养基。 X-Gluc 可被GUS作用而释出蓝色的产物,若转型株所带的质体接有gus 基因的重组质体,则应可在IPTG 的诱导条件下表现出蛋白质,若此重组蛋白质具有GUS 活性,可将进入菌体的X-Gluc 分解而使菌落呈蓝色。
仪器用具:
平端镊子
药品试剂:
Nitrocellulose 滤膜
LB/Amp/IPTG/X-Gluc plate (LB plate 添加100 μg/mL ampicillin, 0.2 M IPTG,
50 μg/mL X-Gluc)
方法步骤:
1) 前一天进行转形的培养皿,当菌落长至约0.5 mm 大小时,将培养皿移至4℃放置至少1 h.
2) 准备一张无菌的硝化纤维滤膜,以铅笔在边缘标上组别。
◆ 请戴手套后再拿取滤膜!
3) 打开培养皿盖子,以两支扁平镊子将滤膜两边夹住,轻轻覆盖在菌落上方,尽可能避免有气泡产生。
◆ 注意!滤膜覆盖上去后就不要再移动!
4) 等滤膜完全湿透后,以针头在滤膜边缘戳洞做记号 (至少做三个记号)。 小心把滤膜掀起,菌落朝上放置在LB/Amp/IPTG/X-Gluc plate 上。盖上盖子,在37℃培养,若转形株带有接上gus 的质体,菌落应在1~2 h 内转呈蓝色。原培养皿则置回37℃使菌落再长出。
5) 将滤膜与原培养皿对照,标出有蓝色菌落位置。 选取数个菌落,以划单一菌落的方式分别接种在LB/Amp/plate 上,置37℃直至菌落长出。 亦同时接种于3 mL LB/Amp 培养液,于37℃震荡培养过夜,以抽取质体,进行限制酶分析。