动物组织或材料中盐酸克伦特罗残留的快速ELISA检测

简介：克伦特罗（Clenbuterol）属于beta兴奋剂，是一种高选择性的兴奋剂和激素，具有水解脂肪、合成代谢和对非条纹肌肉组织的松弛作用。进年来被一些人非法添加到饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物的生长。当用作生长调节剂时，其添加量是治疗量的5—10倍，常在动物体内残留而给消费者带来危害。

通常，HPLC或GC-MS是克伦特罗残留检测的确证方法，但是其前处理步骤费用昂贵，而ELISA快速检测试剂盒因成本低、操作简便、速度快、一次检测样本量大、仪器化低，现已成为常规的筛选方法。

<font>一、检测原理</font>

测定的基础是抗原抗体反应。微孔板上包被有针对兔IgG（Clenbuterol抗体）的羊抗体，含有克伦特罗抗原的样品或标准品与酶标记物被加入到小孔中，经过孵育及洗涤步骤后，游离的抗原与抗原酶标记物竞争抗体结合位点，没有结合的抗原酶标记物在清洗步骤中被除去，将显色液加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝色转为黄色。在450nm处测量，吸光强度与样品的克伦特罗浓度成反比。

<font>二、操作时间</font>

1小时(30分钟孵育 30分钟显色)

<font><strong>三、检测下限</strong></font>

0.1ppb

<font>四、回收率</font>

尿样和血清： 97-110%

饲料： 95-100%

肝脏/组织： 90-97%

牛奶及奶粉 100%

<font>五、交叉反应率</font>

Clenbuterol (克伦特罗) 100%

Mabuterol（马普特罗） 100%

Mapenterol（马喷特罗） 100%

Salbutamal (沙丁胺醇) 8-9%

Terbutalin (特普他林) 7-8%

Simarterol(塞曼特罗) <0.1%

Isoproterenol（异丙肾上腺素） <0.1%

Fenoterol（非诺特罗） <0.1%

<font>六、试剂盒的组成</font>

1、 96孔酶标板：12条╳8孔（包被有抗兔IgG）。

2、克伦特罗标准液6瓶：1ml /瓶，为Clenbuterol水溶液:0.1ng/ml，0.3 ng/ml，0.6 ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml.

3、酶联结合物Conjugate peroxidase： 6ml 黄盖

4、 抗Clenbuterol抗体溶液：Anti-clenbuterol antibody 11ml 红盖

5、冲洗液（需10倍稀释）Wash buffer： 50ml 塑料瓶

6、柠檬酸盐缓冲液Citrate buffer： 25ml 蓝盖

7、底物溶液Chromogen： 3 ml 黑盖

8、样品稀释液（需20倍稀释）Diluent solution: 10ml 绿盖

9、反应终止液Stop solution： 6ml 白盖

<font><strong>七、需要设备及试剂（试剂盒中未提供）</strong></font>

设备：

1、 均质器

2、 振荡器

3、微孔酶标仪（450nm）

4、离心机

5、20ul，50ul，100ul，200ul微量加样器

6、免疫亲和柱（每根柱子可以至少可以纯化120-150个样本，也可以用C18柱纯化）。

试剂：

1、氢氧化钠

2、0.01M HCL

3、5M盐酸

4、蒸馏水

<font>八、工作液的准备</font>

1、洗液：用蒸馏水按（1 9）稀释

2、样品稀释液：将样品稀释液用蒸馏水按（1 19）稀释（注：在使用前再配）。

3、底物溶液：用柠檬酸缓冲液（1 9）稀释（注：柠檬酸缓冲液本试剂盒内有提供，稀释后的溶液避免光线直射）。

注：终止液含硫酸，要小心操作。

<font><strong>九、样品前处理</strong></font>

1、尿液和血清：（稀释因子1）

尿液和血清不用处理，直接测定。（如果尿液浑浊，一定要过滤或离心）

2、肝脏

2.1（简便前处理方法）（稀释因子3）

1） 取1g肝脏样品，加入2ml0.01M HCL.

2） 均质5分钟。

3） 检查pH值是否在6.5-8之间，否则用氢氧化钠或盐酸调节。

4） 离心15分钟3500rpm，或者离心5分钟13000rpm，转移出上清液备用。

2.2.（复杂前处理方法）（稀释因子1）

1） 带有低脂肪的肝，肉或组织。

2） 5g粉碎的样品于25ml 50mM 盐酸混合，振荡15分钟，以达到均质的目的。

3） 称6g均质物（相当于1g肝脏），加入离心瓶中。

4） 10—15℃离心15分钟4000rpm或更高的转速。

5） 转移出上清液至另一个离心瓶中，加300ul 1M 氢氧化钠混合15分钟。

6） 加入4ml 500mM 磷酸二氢钾缓冲液pH3.0，简单混合并在4℃保存至少1.5小时或过夜

7） 在10-15℃离心15分钟，4000g或更高转速。

8） 分离全部上清液（应该是清亮的），使其升至室温（20-24℃），然后用C18柱纯化（见C18柱纯化步骤）。

9） C18柱纯化方法：

所有试剂和样品处理必须在室温下（20-24℃）并严格控制过柱时的流速。（非常关键）

①用3ml100%甲醇洗涤柱子，流速为1滴/秒。

②用2ml洗涤液洗涤柱子（50mM磷酸二氢钾缓冲液pH3.0）。

③样品进柱。

④用2ml洗涤液洗涤柱子（50mM磷酸二氢钾缓冲液pH3.0）。

⑤用正压去除残留的液体并用空气或氮气吹2分钟干燥柱子。

⑥用1ml100%甲醇洗脱样品，流速为15滴/分钟。

⑦在50-60℃弱空气或氮气流下完全蒸发溶剂。

⑧用1ml蒸馏水溶解干燥的残留物，备用分析。

3、饲料（稀释因子10）：

1) 用乳钵研碎饲料，称1g研碎的饲料样品加入10ml0.01M的盐酸，充分混合5分钟。

2) 检查pH值是否在6.5-8之间，否则用氢氧化钠或盐酸调节

3) 离心5分钟3500rpm，转移出上清液。（如上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤）