免疫化学方法测定动物组织中呋喃唑酮残留标示物

　　【摘要】  以自制特异性抗体为核心试剂，建立了以苯甲醛为衍生试剂的呋喃唑酮残留标示物间接竞争ELISA方法。通过方阵滴定法和间接竞争法确定ELISA方法最佳反应条件：抗原最佳包被浓度200 μg/L，抗体最佳稀释倍数1∶2.5×105，抗体与药物最佳工作配比40 μL∶60 μL，最佳竞争时间1 h。检出限为0.1 μg/L，检测范围0.1～25.6 μg/L，线性关系良好。在空白组织中（猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏、鱼肉）添加0.4、1.0和5.0 μg/kg AOZ，回收率55.8％～96.6％，相对标准偏差均小于20％。测定20份不同组织的空白样品，方法的检出限为0.4～0.5 μg/kg。以100 mg/kg呋喃唑酮饲喂动物，其组织样品同时经HPLC方法和本方法测定，数据表明本方法具有实际检出能力，测定结果与仪器方法的测定结果相近。通过与德国同类试剂盒比较实验表明，本方法的灵敏度、精密度、准确度接近于进口试剂盒水平，可用于动物可食性组织肝脏和肌肉中AOZ筛选。

　　【关键词】  呋喃唑酮 32氨基222恶唑烷酮 免疫分析 动物组织 残留

　　1  引言

　　呋喃唑酮属于硝基呋喃类抗菌药，常用于防治畜禽肠道感染。据毒理学研究发现，呋喃唑酮具有较强的致癌、致畸、致突变作用[1，2]，欧盟[3]、美国、中国等均禁止在畜禽生产中使用。但由于呋喃唑酮抗菌效果良好，仍有滥用现象，残留超标事件时有发生。因此开发灵敏高效的呋喃唑酮残留的检测方法具有重要意义。

　　呋喃唑酮在体内很快代谢成32氨基222恶唑烷酮（AOZ），且存留较长时间，被视为残留标示物[4，5]。检测AOZ 时，通常先将AOZ从组织解离出来，再与衍生试剂22硝基苯甲醛生成32（22硝基苯亚甲基）2氨基222恶唑烷酮（NPAOZ），通过检测NPAOZ达到检测AOZ的目的。目前检测AOZ残留的方法有LC2UV[6]、LC2MS[7]和LC2MS2MS[8]，我国检测呋喃唑酮标准主要有HPLC（SC/T 302222004）、HPLC2MS（GB/T 18932.2422005）。该类技术所需设备要求较高，不适合高通量样品筛选［９］。酶联免疫吸附法（ELISA）具有灵敏度高、特异性好、成本低等特点，适于高通量样品筛选。德国Bio2pharm公司研发出AOZ酶联免疫试剂盒[10，１１]，其检测仍要将AOZ衍生成NPAOZ。目前，中国没有建立酶联免疫快速筛选方法，国内所用试剂盒主要依靠国外进口。因此，我国急需建立快速筛选呋喃唑酮的ELISA方法。本研究以本实验室制备的AOZ特异性抗体（特异捕获AOZ与苯甲醛的衍生物N2苯亚甲基232氨基222恶唑烷酮，PAOZ）为基础，建立了呋喃唑酮残留标示物ELISA方法，检测目标化合物为PAOZ，具有一定的创新性和重要的经济价值。

　　2  实验部分

　　2.1  试剂、仪器及实验动物

　　AOZ、PAOZ、AOZ特异性抗体（华中农业大学国家兽药残留基准实验室）；HRP2羊抗兔IgG（Pierce）；卵清蛋白（Sigma公司）；呋喃唑酮（山东金泰集团股份有限公司）；苯甲醛（上海化学试剂公司）；德国AOZ检测试剂盒（Bio2pharm）；OasisTM MAX 固相萃取柱（Waters公司）；其它试剂均为AR级。高效液相色谱仪（Agilent hp1100 series型）；酶标仪（SUNRISE MagenllanCE 2.5型）。长大二元杂交去势仔猪，45日龄，体重（15.0±2.0）kg，购于华中农大试验猪场；鸡肉、鸡肝、鱼购于超市。

　　2.2  实验方法

　　2.2.1  间接竞争ELISA  用包被缓冲液将包被抗原（改造半抗原与卵清蛋白偶联物）稀释至适当的工作浓度，每孔100 μL，置于4 ℃ 12 h；洗涤后用1％的卵清蛋白37 ℃封闭1 h，加入系列浓度药物（PAOZ）标准品60 μL和药物抗体（特异捕获PAOZ）40 μL，37 ℃湿盒放置1 h，洗涤后每孔加入100 μL 1:10000的HRP2羊抗兔IgG，置37 ℃湿盒1 h，洗涤后每孔加入新鲜配制的底物溶液，置于37 ℃显色10～15 min后，每孔加入50 μL的终止液，于450 nm测定各孔的吸光值[1２]。

　　2.2.2  ELISA最佳反应条件优化  采用方阵滴定法和间接竞争ELISA法优化抗原最佳包被浓度、抗体最佳工作浓度、抗体最佳工作量、最佳竞争时间[13，１４]。在上述最佳条件下，将PAOZ母液稀释成0、0.1、0.4、1.6、6.4和25.6 μg/L系列浓度（数值实为AOZ浓度），按间接竞争ELISA方法进行测定，以PAOZ溶液浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准曲线，其中抑制率（%）＝100B/B0，B0和B分别为零标准孔和含药物孔所对应的吸光值。

　　2.2.3  样品衍生与提取  取1 g组织均质物，加入蒸馏水5 mL，1mol/L HCl 0.5 mL和0.01 mol/L的苯甲醛（甲醇溶液）100 μL，充分振荡，于37 ℃水浴锅孵育16 h。分别加入5 mL 0.1 mol/L K2HPO4、200 μL HClO4，剧烈振荡30 s，5000 r/min室温离心10 min。上清液移至另一容器，用5 mol/L NaOH溶液调pH至7.0，安装OasisＴＭ MAX固相萃取柱，分别用3 mL甲醇和3 mL蒸馏水活化，加入上述样品，用3 mL 2％氨水溶液洗涤，3 mL甲醇洗脱，正压吹干，收集洗脱液。40 ℃氮气吹干，向收集瓶中加入PBS（pH 7.4）1 mL，振荡30 s，作为试样溶液[6]，供ELISA方法测定。

　　2.2.4  动物考核实验  取长大二元杂交去势健康仔猪15头，随机分为5组。第1组为空白对照组，其余4组饲喂含100 mg/kg的呋喃唑酮7 d，于停药0、7、14、28 d分别屠宰3头，空白对照组分别在停药0、7和28 d屠宰1头，采用ELISA法和HPLC法同时测定猪肝脏、肌肉中AOZ的含量。HPLC测定条件：色谱柱，ZORBAX XDB2C18，250 mm×4.6 mm；检测波长 255 nm；流动相：V（KH2PO4）∶V（乙腈）∶V（甲醇）=65∶30∶5。

　　3  结果与讨论

　　3.1  ELISA最佳反应条件

　　方阵滴定初步确定抗原包被工作浓度为250 μg/L，抗体稀释比为1∶3.2×105。包被抗原以250 μg/L为中心浓度包被5个不同浓度，作间接竞争ELISA，结果（图1）显示包被抗原为200 μg/L时，抑制率下降最快，为抗原最佳包被浓度。抗体以3.0×105为中心浓度稀释成5个不同浓度，作间接竞争ELISA，结果显示抗体稀释比为1∶2.5×105时，抑制率下降最快，为抗体最佳工作浓度。设计4个抗体与药物的工作配比（60∶40、50∶50、40∶60、30∶70），作间接竞争ELISA，结果显示抗体与药物40 μL∶60 μL时，抑制率下降最快，为最佳工作配比。包被200 μg/L抗原，经5个不同时间（0.5、1.0 、1.5、2.0和3.0 h）竞争反应，结果表明，经过1 h的反应后，OD值趋向稳定，竞争反应达到平衡状态，为最佳竞争时间。

　　图1  不同包被抗原浓度对竞争反应的影响（略）

　　Fig.1  Influence of various concentration of coating antigen on competition reaction

　　（□） 350 μg/L；（○） 300 μg/L; （△） 200 μg/L; （y） 150 μg/L; （ü） 250 μg/L; PAOZ: 32[N2phenyl2methylene］2amino222oxazolinone．

　　3.2  标准曲线

　　在ELISA最佳反应条件下绘制标准曲线，图2显示标准曲线在0.1～25.6 μg/L范围内，线性关系好，回归方程y＝－30.367x+49.653， r＝ 0.9939，标准品最低检出限0.1μg/L， IC50达0.95 μg/L。结果表明本方法灵敏度高。

　　图2  PAOZ标准曲线（略）

　　Fig.2  Enzyme2linked immunosorbent assay(ELISA) standard curve for PAOZ

　　3.3  方法的检出限、回收率与相对标准偏差

　　以10个空白组织的测定浓度加上3倍标准差为组织中检出限[1５]。测定20份空白样品结果见表1。猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝、鱼组织中的检出限均低于0.5 μg/kg，欧盟规定AOZ在可食性组织存在最大量不得超过1.0 μg/kg，本ELISA方法的灵敏度满足欧盟官方规定，可以准确筛选组织中AOZ残留。

　　将1 g/L AOZ母液稀释成适当浓度，添加到1g匀浆组织中使其终浓度为0.4、1.0和5.0 μg/kg，每个浓度3个平行，重复5个批次，间接竞争ELISA测定样品中AOZ浓度，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。

　　回收率结果（表1）显示各组织中AOZ回收率在55.8％～96.6％之间，批间变异系数均<20％，在低浓度（0.4 μg/kg）和中浓度（1.0 μg/kg）方法的准确度和精密度符合兽药残留筛选分析方法的要求，而高浓度（5.0 μg/kg）回收率最低达55.8％，提示本方法样品提取效率不高，有待进一步优化。

　　表1  检出限、空白组织提取回收率和相对标准偏差（略）

　　Table 1  Result of  LOD, recoveries and coefficient of 32amino222oxazolidone(AOZ) in blank tissues

　　LOD： 检出限（limit of detection）＝+3 SD。3.4  假阳性率和假阴性率

　　分别测定20个空白猪肉样品，20个添加AOZ猪肉样品（浓度为0. 5和1.0 μg/kg），评价ELISA方法假阳性率和假阴性率。

　　图3  空白猪肉组织、添加0.5和1.0 μg/kg猪肉样品的测定浓度（略）

　　Fig.3  Concentration of blank swine muscle, 0. 5 μg/kg and 1.0 μg/kg spiked swine muscle

　　由图3可知，20个空白猪肉样品测定值均低于检出限（0.4 μg/kg）以下，而添加0.5和1.0 μg/kg的样品，除了一个样品外，其余样品均高于检出限。因此，本方法未出现假阳性结果，在0.5 μg/kg浓度，假阴性率为5％，在1.0 μg/kg浓度，未出现假阴性结果，符合我国筛选方法假阴性率不得超过5％的规定。结果表明，本方法能准确区分阴性样品和1.0 μg/kg的阳性样品。

　　3.5  动物实验

　　空白肝脏与停药28 d肝脏组织色谱图见图4。动物试验测定结果（表2）显示ELISA方法测定肝脏、肌肉中AOZ含量与HPLC相近，证明了本方法具有检测实际样品的能力，可特异性的区分加药组和空白对照组，测定结果准确、可靠，可用于食品动物可食性组织肝脏、肌肉中AOZ残留检测。

　　3.6  同类试剂盒比较

　　参考欧盟兽药残留分析标准实验室评价ELISA试剂盒的质量参数[1５]。本ELISA方法和德国试剂盒检测能力相当，检出限均为0.1 μg/L。在空白猪肝、猪肉样品中添加0.4、1 .0和5.0 μg/kg的AOZ，同一份样品分别用本ELISA方法和德国试剂盒测定，结果见表3。本方法回收率（61.0％～92.5％）接近德国试剂盒（75.2％～127.5％）水平，均属于正常波动范围。但ELISA方法在高浓度回收率（61.0％）低于德国试剂盒水平（76.4％），其原因可能是本方法的样品提取效率低于德国试剂盒样品提取效率，因此有必要对本方法样品提取程序作进一步的探索。

　　图4  空白猪肝脏（A）和肝脏样品（B）色谱图（略）

　　Fig.4  Chromatograms of blank swine liver (A) and liver sample (B)

　　表2  饲喂呋喃唑酮猪肝脏和肌肉中AOZ含量的测定结果（μg/kg，n＝3）（略）

　　Table 2  Detection of AOZ in liver and muscle tissues from pigestreated with feed containing 100 mg/kg furazolidone（μg/kg， n＝3）

　　“ND”： 表示未检测出（no detection）； HPLC的检出限（LOD of HPLC used in this study） 5μg/kg。

　　表3  同类试剂盒回收率比较（略）

　　Table 3  Comparison of recoveries of two kits

　　－：未计算（no calculation）。

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