DNA连接技术

[原理]

利用DNA 连接酶把载体 DNA 和要克隆的目的 DNA 片段连接在一起，成为一个完整的重组分子，这就是分子克隆中常说的连接反应。当载体 DNA 和外源 DNA 末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话（同尾酶也可以），或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源 DNA 两端的限制性内切酶切点 ，从而使我们能方便地从重组分子再次取出所克隆的DNa段。

[操作]

（1 ）取 3 支 eppendorf 离心管，标上 1 、2 、3 号。

（2 ）按下 表依次加水、V-DNA ，在 2 ，3 号管加 P-DNA 。

                           表    连接反应各管加样情况

 

管号       V-DNA         P-DNA          ddH2 O        10 × Buffer     T4连接酶               (μl)         (μl)          (μl)                      (0.2μ/ml)

1            1                            7              1              1   2            1              8              1         3            1             5              2              1              1

 （3 ）离心 3 秒，置 65 ℃保温 10 分钟，然后取出插入冰中。

（4 ）用 T4 DNA 连接酶稀释液把 T4 DNA 连接酶稀释至 0.2 U / ml 。

（5 ）按表中所示的量加入 10 ×缓冲液，在 1 及 3 中加连接酶。

（6 ）混匀，离心3 秒钟，置 12 ℃恒温水浴过夜。次日取出，如不做转染放 -20 ℃保存。2 和 1 为对照，以检查 V-DNA 的酶切效果和连接酶连接效果。

现在宝灵曼公司已推出快速连结 DNA 试剂盒。该试剂盒能在室温下 5 分钟内将粘性末端或平头末端片段连接。进行反应需要的所有试剂已包括在试剂盒内。

［试剂与器材］

l ．试剂

（l ）载体 DNA(V-DNA): M12 mp19RF DNA ，经 BamHI 切割 ,分子量约 7.2kb ，浓度约 lμl ＝10 ng 。

（2 ）外源 DNA(P-DNA): AcNPV 变株 m29DNA 的 BamHI 切割产生的 F 片段，分子量约 1.9 kb ，浓度 1μl=5ng 。

（3 ）10 ×连接反应液： 700 mmol / L Tris-HCl ，pH7.5 ，70mmol / L MgCl₂ ，0.7mmol / L ATP 。

（4 ）T4 DNA 连接酶稀释液： 50mmol / L Tris-Cl ，pH7.5 ，500μg/ml BSA （牛血清白蛋白）。

2.器材 恒温水浴器。