高效感受态细胞制备

方法一：

效率非常高，一般可到1undefined8，好时可到1undefined9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

实验试剂：

A液：1M，MnCl₂：

B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；

C液 称取CaCl₂ 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。

实验步骤：

1、划线得到单菌落，37℃培养箱培养约17小时。

2、  挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶，37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时。

3、将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多。

4、每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮。

5、加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。

6、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。

7、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

注意事项：

1、洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。

2、离心力要注意不要超过2500g，建议1500-2000g 5min。

3、涂板不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。

4、涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

5、预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要。

方法二：

本法效率极高，建议大家采纳。

实验步骤：

1、液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌E.COLI_DH5，JM109，HB101等，在LB平板上划线，37度过夜至长出单菌落。

2、挑直径1-3毫米的单菌落可多个，接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多，会影响效率。

3、在18度 150-250RPM 培养19-50小时。没有冷却摇床的可在室温，但不可高于37度。

4、OD₆₀₀约0.4-0.8时停止培养，放在冰水中冷却10分钟。

5、4度，300RPM离心15分钟，回收菌体。

6、去掉上清后，用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮，在冷10分钟。

7、再次离心回收菌体。

8、用1/12.5体积的TB悬浮，添加最终浓度为7%的DMSO，再冷却10分钟9.0.1-1毫升分装，直接在液氮中冻上。

9、在液氮或-80度保存。

10、将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。

11、挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。

12、当OD₆₀₀=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。

13、用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。

14、重复第4步操作。

15、用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。

16、冰浴10min后，分装保存于液氮中。