感受态细胞制备实验

一、CaCl₂ 感受态细胞的制备的实验步骤

1．前夜接种受体菌（ DH5α或 DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；

2．取 1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；

3．将 0.1M CaCl₂ 溶液置于冰上预冷；

以下步骤需在超净工作台和冰上操作

4．吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；

6．弃去上清，加入 100μl预冷0.1M CaCl₂ 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；

7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；

8．弃去上清，加入 100μl预冷0.1M CaCl₂ 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（ 15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

二、电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤

1．前夜接种受体菌（ DH5α或 DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；

2．取 2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600 =0.6（约2.5-3小时）；

3．将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作

4．吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；

6．弃去上清，加入 1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

7．4℃下3000g冷冻离心5分钟

8．弃去上清，加入 750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9．4℃下3000g冷冻离心5分钟

10．加入 20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

11．立即使用或迅速置于 -70℃超低温保存。

附注：

影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：

1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600 来控制。DH5α菌株 OD600 为 0.5 时细胞密度是 5 × 10⁷ /ml ）；

2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；

3．经 CaCl₂ 处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加， 24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；

4．化合物及无机离子的影响：在 Ca²⁺ 的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn²⁺ 或 Co²⁺ ）、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）；

5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；

6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ；

7．一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比。