胶体金免疫标记技术-蛋白-金复合体的制备
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一般认为胶体金粒子表面为一层 AuCl2 ，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。
金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于 pH 值，这是因蛋白的净电荷取决于溶液的 pH 值，在 pH=pI 时为中性。由于在 pH=pI 时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中，一般胶体金调整为 pH=PI+0.5 ，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。
胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（ 1 ）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。（ 2 ）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。（ 3 ）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（ 30 kD ），形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如 BSA ，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。
当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳 pH 值。对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同 pH 值得胶体金结合后，只有某一特定 pH 值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如 NaCl ）作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜 pH 范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜 pH 值为最佳 pH 值。但有些探针的实际情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。
在确定最佳 pH 值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚，并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭”（ Blocking ）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况下要特别注意。
这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳 pH 也有一定变化。
因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。
1 、抗血清的前处理
一般抗血清中 IgG 的含量为 10-25% ，而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此，否则会导致 IgG 活性的大幅降低。如果你的实验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持，高度纯化后效果会更好。
大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的 IgG 蛋白。其基本步骤如下：
(1) 取抗血清 0.2 ml ；
(2) 加生理盐水（ 0.85 ％ NaCl ） 0.3 ml ，混匀；
(3) 逐滴加入饱和 (NH4 )2 SO4 0.5 ml ，充分振荡混匀， 4 ℃静置 1 h ；
(4) 10000 rpm/min 离心 20 min ，弃上清；
(5) 加 0.5 ml 生理盐水重悬浮，混匀；
(6) 逐滴加 0.25 ml 饱和 (NH4 )2 SO4 ，充分振荡混匀， 4 ℃静置 1 h ；
(7) 10000 rpm/min 离心 20 min ，弃上清；
(8) 重复 5 ～ 8 步骤一次；
(9) 加生理盐水 0.5 ml 重悬浮，混匀；
(10) 生理盐水中透析 12 ～ 24 h ；
(11) 在 0.2 M pH 9.0 硼酸缓冲液透析 12 ～ 24 h ；
(12) 分装，即将使用时 4 ℃保存，备用 -20 ℃保存。
为最大限度保持抗体活性，整个过程应在 4 ℃下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生理盐水透析改为 3 M KCNS 透析，促使聚合的多聚体解聚。如果抗血清效价较低时，不宜准备胶体金探针。
2 、亲和纯化抗体的处理
亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗体。这些抗体一般有两个问题，一是 IgG 分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有较多的盐分。因此前处理的目的在于脱盐和解聚。
其基本步骤如下：
(1) 将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为 0.5-1 mg/ml 浓度
(2) 在 3 M KCNS （硫氰酸钾）溶液中透析 12 h
(3) 在 2 mMol pH 9.0 的硼酸缓冲液中透析 12 h （更换透析液数次）
(4) 分装备用
其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的 pH 值应与交联时 pH 值一致。在实际运用中，一般省略去 3M KCNS 透析这一步，特别是当蛋白分子量较小，且为非糖蛋白时。我们建议在制备通用探针（如二抗 IgG ， Protein A ， Protein G ， Streptavidin ）等时，严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。
3 、 IgG Fab 片段的制备
一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易于靶位点结合。
IgG 分子量为 150 kD 左右，由 4 个亚基组成，即两条重链（ H ）和两条轻链（ L ）。用水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到两种片段，即 Fab 和 Fc 。其中 Fab 是具有抗原识别活性的部分，回收后制备探针。 Fc 能够与 Protein A 和 Protein G 特异性结合。但这种分离只能在有条件的实验室进行。
其基本过程如下：
(1) 用 PBS （ pH 7.0 ，含 10 mM EDTA ， 20 mM 盐酸半胱氨酸）溶解纯化的 IgG
(2) 加固化木瓜蛋白酶
(3) 37 ℃处理 5h
(4) 离心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀）
(5) 过 Protein G 柱
(6) 纯化的 Fab 片段按前文方法做进一步处理
注： Fab 与胶体金结合的 pH 值为 6.5
4 、蛋白与胶体金结合最佳 pH 测定
( 例纤维素酶， pI 未知 )
(1) 取若干个 1.5ml 试管，分别加入 1 ml 10 nm 胶体金；
(2) 用 25 mM K2 CO3 将 pH 分别调为 3 ， 4 ， 5 ， 6 ， 7 ， 8 ， 9 ， 10 ；
(3) 取一 96 孔培养板，按 pH 从低到高分别将上述胶体金分别取 100 m l 加入孔中，重复三次；
浙江大学电子显微镜室, 浙江大学生物技术研究所
胡东维 洪 健 徐 颖
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