免疫标记技术

免疫标记技术（immunolabelling techniques）是指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂作为示踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应，借助于荧光显微镜、酶标检测仪等仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可在细胞、亚细胞以及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性定量测定。

根据标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术可分为酶免疫的技术（以酶联免疫吸附试验为常用）、免疫荧光技术、放射免疫技术、发光免疫测定技术等，本节主要介绍酶联免疫吸附技术以及免疫荧光技术。

　　一、酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化作用相结合而发展起来的一种免疫标记技术，既可用于组织、细胞内抗原的检测，又可用于体液中抗原抗体的检测。根据检测方法的不同，可将酶联法分为双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法和其他ELISA，现介绍前三种。

1. 双抗体夹心法　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，将已知抗体包被于微孔条上，加入待检品（抗原）形成抗原抗体复合物，加酶标抗体与之结合，经显色后用酶标仪测定OD值，从而测定相应抗原含量。

（1）以pH9.6碳酸盐缓冲液稀释已知抗体包被酶标板，4℃过夜。市售商品往往已经预先包被好已知抗体。

（2）将酶标板、试剂等平衡至室温，分别于相应孔内加入待检样品、阴性对照、阳性对照50μl。

（3）分别在每孔内滴加酶标抗体50μl。置37℃温育60min。室温平衡5min，甩干孔内液体，洗液洗涤5次，拍干。

（4）每孔加显色剂，37℃避光温育10min。

（5）每孔加终止液50μl，轻拍混匀。

（6）酶标仪测定OD值，用空白调零。样本OD值/阴性OD值（S/N）≥2.1（同时待检杯OD＞0．10）判为阳性。

2. 间接法　间接法是检测抗体最常用的方法， 将已知抗原吸附于固相载体，加待检血清（抗体）形成抗原抗体复合物，经孵育、洗涤后，加酶标抗体使之与抗原抗体复合物结合，经显色后用酶标仪测定OD值，从而间接测定相应抗体含量。步骤如下:

（1）以pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释已知抗原包被酶标板，4℃过夜。市售商品往往已经预先包被好已知抗原。

（2）在预包被已知抗原酶标板内加入待检样品、阴性对照、阳性对照50μl。置37℃温育25～45 min。用洗液洗涤5次，拍干。

（3）分别在每孔内滴加酶标抗体100 μl。置37℃温育25～30min，洗涤。

（4）每孔加显色剂，轻拍混匀，37℃避光温育10min。

（5）每孔加终止液50μl。

（6）酶标仪测定OD值，用空白调零。样本OD值/阴性OD值（S/N）≥2．1（同时待检杯OD＞0．10）判为阳性。

3. 竞争法　竞争法既可用于抗原半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以抗原竞争法为例，将已知抗体吸附于固相载体，加一定量已知酶标抗原及待测抗原，使两者竞争与固相抗体结合，经洗涤，最后结合于固相抗体上的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。步骤如下：

（1）已知抗体包被酶标板，4℃过夜。

（2）测定管内加一定量酶标抗原和待检样品，对照管内只加相同量酶标抗原。温育，洗涤。

（3）分别于测定管、对照管内加一定量底物显色。

（4）用酶标仪测定对照管、测定管内OD值，用空白调零。通过对照管与测定管OD值之差，计算标本中待测抗原含量。

进行ELISA操作时应注意以下几点：

①实验室温度应控制在18℃～25℃；

②加样须准确，同一样本设立对照管、测定管各两孔，取其平均值；

③严格控制温育反应温度及时间，洗涤应充分；

④结果判定应以仪器为准，肉眼仅作参考。

　　二、免疫荧光技术

免疫荧光技术是将荧光素如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)与相应抗体（或抗原）以化学的方法结合，将荧光标记抗体（或抗原）与标本中相应的抗原结合形成荧光标记的抗体-抗原复合物，用荧光显微镜观察。

在镜下见到有荧光存在即推断有抗原抗体复合物的存在，根据已知的抗体（或抗原）即可推知另一个未知抗原（或抗体）的存在。

1. 直接免疫荧光法　直接免疫荧光法是利用荧光色素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以鉴定未知抗原。本法具有操作简单、时程短、特异性高的优点，但也存在缺点如不能检查抗体，敏感性较差。

（1）在标本上滴加荧光素标记抗体，放入湿盒中。37℃温育30min。

（2）PBS冲洗后，再用PBS分三缸浸泡，每缸3min。

（3）PBS浸泡1～2min，风干。

（4）缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察。

进行直接免疫荧光法时应注意：

①温育时一定要将玻片放在湿盒中，以防液体蒸发。

②用PBS浸泡时应不断振荡。

2. 间接免疫荧光法　间接免疫荧光法以荧光素标记抗球蛋白抗体，抗体与相应抗原结合后，荧光标记的抗球蛋白抗体与已结合的抗体发生作用，从而推知抗原或抗体的存在。间接荧光技术可以用已知的抗原检测未知的抗体，也可用已知的抗体测出未知抗原。现以检测流行性出血热病毒抗体（IgM）为例介绍如下：

（1）将待测病人血清加至抗原片（流行性出血热病毒感染的Vero-E6细胞片）上，每个稀释度加2孔，最后2孔加PBS做对照。将玻片放置湿盒中，37℃温育60min。取出玻片，弃去反应液，用PBS洗涤5min，风干。

（2）加入1∶40稀释的FITC标记的羊抗人IgM，37℃温育60min。取出玻片，按步骤2洗涤，风干。

（3）PBS甘油封片，荧光显微镜下观察。阳性结果：在细胞膜及细胞质中可见颗粒状荧光颗粒，细胞核呈红色。

注意事项：温育时将玻片放在湿盒中，以防液体蒸发。选择低温、干燥、洁净的环境风干。