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Omega质粒DNA中量提取流程

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3638

实验试剂

 

1. 使用前,将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。

2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer,并于室温保存。

    D6915-01:加入80ml无水乙醇

    D6915-03: 加入200ml无水乙醇

    D6915-04: 每瓶中加入200ml无水乙醇

实验步骤

 

1. 将带有质粒的E.coli 接种于30-50ml LB/抗生素培养液中,37°C搖床培养12~16 h;

2. 取30-50ml的菌液,室温下3,500-5,000xg离心10min收集细菌。

3. 倒弃培养基。加入2.5ml Solution I/RNaseA混和液,漩涡振荡使细胞完全悬浮。

4. 往重悬混和液中加入2.5ml Solution Ii,轻轻颠倒混匀7-10次后可将混合液室温放置2min以提高产量。避免剧烈混和裂解液且裂解反应不要超过5 min。

5. 加入1.25ml 冰浴Buffer N3,并温和颠倒离心管数次至形成白色絮狀沉淀。准备好过滤器。

6. 把HiBind中量柱套在收集管中,加入2ml Buffer GPS至柱子中,静置3- 10min。室温3000-5000xg离心5分钟。去滤液,把柱子重新放回收集管中。

7. 将裂解液倒进预先准备好的针筒过滤器中(针筒开口朝上,下面出口处接收集管),静置2min。

8. 插入并轻推活塞使裂解液流进下面的收集管中。

9. 在过滤澄清的裂解液中加入1/10体积的ETR,颠倒7-10次后溶液变得浑浊,冰浴10-20min。

10. 42°C水浴5min后,25°C,3,000-5,000xg离心5min,ETR溶液将在管底形成蓝色分层。离心后,如果溶液中有大量的液滴悬浮,静置10分钟让液滴自然沉降。

11. 转移上清液移至离心管中,加入0.5倍体积无水乙醇(室温),混匀后室温静置1-2min。

12. 将HiBind® 中量柱装在15ml收集管中。转移20ml混合液至柱子內,室温下3,000-5,000xg离心3-5 min,倒去滤液。

13. 重复该第12步骤,把剩余的过滤液转移至柱子,直至所有的溶液都从柱子滤出。

14. 把柱子重新装回收集管,加入3ml HB Buffer,按上述条件离心,弃滤液。

15. 把柱子重新装回收集管,加入3.5ml DNA Wash Buffer,按上述条件离心,弃滤液。

16. 重复步骤15一次。

17. 弃去滤液,把柱子重新装回收集管,最大速度(< 6000xg)离心10-15min以甩干柱子基质。

18. (可选)进一步干燥柱子,将柱子从收集管中取出,用真空抽滤装置抽干柱子10min后,也可在真空烘箱或65°C 干燥10min后重复步骤17。

19. 把柱子装在干净的15ml离心管上,加入70°C预热的0.5-1ml Endotoxin free Elution Buffer到柱子基质上(所加的量取决于预期终产物浓度),室温下静置2min后最大速度离心5min以洗脱DNA。

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