合适的小鼠胚胎干细胞胞质分裂阻断微核试验(CBMn)分析
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实验试剂
原液的浓度为14.3 M(纯液体),准备β -巯基乙醇溶液的工作液,加入70μl 2-巯基乙醇原液(14.3M)溶于10 ml PBS ,过滤消毒和储存在阴凉的地方。
Bisbenzimide H 33258,(Calbiochem,382061,100 mg)
杜尔贝科的磷酸盐缓冲生理盐水无 Mg2 和Ca2 (D - PBS)(Sigma;D5652)。不要加热,立即过滤消毒。
二甲基亚砜(Sigma,Hybrimax,无菌过滤;D2650)
EGTA粉(Sigma,E-4378)EDTAD对镁具有高亲和力,对钙具有较低亲和力,而EGTA具对钙具有高亲和力,对镁具有较低亲和力。EGTA工作浓度为2mM。
胚胎干细胞适合的胎牛血清(ES FCS),(Gibco;16141-079)FCS可能包含可以促进胚胎干细胞分化的不确定因素,因此每批产品必须事先筛选。
小牛血清(FBS),(Invitrogen,10270-106)在-20ºC 保存,用前37ºC水浴解冻。解冻后,胎牛血清可保存于4ºC,3-4周。
白血病抑制因子(LIF)(ESGROTM;13275)此因子通常被用来协助维持mESCs的多能性。
丝裂霉素C粉(Sigma;M0503)请注意,在培养基中的MIT-C(38℃)中含有抗生素和血清,随着时间的推移而降解。
胰蛋白酶EDTA(1X)的HBSS无Mg2 和Ca2 (GIBCO 25300-054),(pH值7.8-8.7)
实验步骤
1. BD基底膜™(BD Biosciences;cat. #354277)
由于基底膜™矩阵超过10℃形成凝胶,应保持在一个较低的温度。因此,所有的设备和试剂使用前应被冷藏冰上。基底膜™准备,从原液中添加350μL到6 ml 预冷媒介。4℃解冻基底膜™。
将5毫克的固体细胞松弛素-B溶于1毫升的二甲基亚砜。按以下方法配置浓度5000Cµg/ml的Cyt-B (1000倍溶液):
3) 用2.5毫升无菌注射器,通过密封盖注射1毫升DMSO。
4) 轻轻摇晃混合物。细胞松弛素-B的容易溶解在二甲基亚砜。
5) 混合,混悬1000倍50μL的原液,分装到0.5毫升无菌聚苯乙烯管。标注日期和 “CYT-B”
7) 分别加450μL和4950μL的DMEM培养液,制备100倍和10倍的Cyt-B 。
1) DMEM培养基(Gibco;12800 -116)13.5 g/ L
3) 青霉素/链霉素(Gibco;15070-063)10 ml/L
将以上成分加入烧瓶中,搅拌加入1N NaOH或1N盐酸调整比预期的工作pH值(7.0-7.4)低0.2-0.3单位。碳酸氢盐缓冲溶液的pH值通常在过滤时提高0.1-0.2单位。
1) Knock-out™ DMEM培养基(Gibco;10829-018)500毫升
2) 青霉素/链霉素(Gibco;15070-063)5毫升
5) ES-FCS(Gibco;16141-079)75毫升
分装避光保存于于4ºC。50毫升KO-DMEM,500μLL-谷氨酰胺和50μL LIF是需要的
1) 添加3-4毫升0.1%的无菌明胶覆盖于T-25细胞瓶的底部。
3) 从涂层表面移除多余的液体,让干燥的空气流通约1/2小时(或者可以允许风干过夜)。
4) 在加入细胞前细胞瓶用用无菌组织培养液或平衡盐溶液冲洗。
2) 加入200μLMit-C至10毫升细胞培养液,37摄氏度孵育90分钟。
4) 消化和悬浮细胞,每个培养瓶加入2.5×106 个细胞,值调pH。旋转和摇晃细胞瓶使细胞分布均匀。成纤维细胞附着,通常需要1-2小时。
1) 0.1816克胸苷粉末溶解在10mlPBS得到75 mM的胸苷溶液(原液)。
2) 加入100μL原溶液至3毫升培养基(胸苷最终浓度为2.5mM)。
3.加入2 ml PBS冲洗细胞瓶两次,轻轻摇动30秒,吸出缓冲液暴露所有媒介含胎牛血清。
4.每个培养瓶加入适量的胰蛋白酶,使之覆盖整个表面。室温孵育约1分钟,快速回来晃动培养瓶4-5次使胰蛋白酶侵入细胞。孵育1分钟后,吸取胰蛋白酶吹打细胞瓶,使连接松散的细胞脱落和团块分解。
5.加入新鲜的,完整的介质使胰蛋白酶失活。一定要在胰酶失活前单细胞。
1.加入2 mM胸苷培养16个小时,使得干细胞达到25-30%汇合。
2.加入1X PBS洗涤除去胸苷,加入新鲜的KO-DMEM完全培养液培养4个小时,释放细胞。细胞达到G2期有丝分裂阶段。
1.将ES细胞生长于含有4 µg/ml cyt-B的 mEF上,培养14小时。
4.室温下孵育10分钟,再次离心细胞降速细胞,用Carnoy`s fixative (甲醇:冰醋酸3:1)室温固定细胞15分钟,并修复与酷卡诺的固定液沉淀15分钟,在室温下。固定前分散细胞。
干燥切片不要超过10分钟,否则细胞和分子形态会改变。应将切片保存于储存在阴凉,干燥,无灰尘的盒子里。
1.人体淋巴细胞的MNI直径,通常为核平均直径的1/16和1/3,这到BN细胞核面积1/256和1/9。
4.MNI可能接触但不会与主核重叠。显微核的边缘与核边缘区分。