聚乙二醇沉淀法检测循环免疫复合物
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实验原理
一定浓度的MW6 000~8 000的聚乙二醇(PEG),能沉淀免疫复合物,但不能沉淀正常球蛋白,沉淀的免疫复合物可用放射免疫法或用分光光度计测定其含量。
实验试剂
1. 0.1mol/L硼酸盐缓冲液称取硼砂0.64g,硼酸0.51g溶解于100ml蒸馏水中,pH值8.4。
2. 6%PEG取6gPEG(MW6 000),溶于100ml硼酸盐缓冲液中。
3. 氯化铯溶液称取CsCl 1g,溶解于14ml蒸馏水中。
4. 热凝聚IgG、试验血清、毛细沉淀管(3×60mm)等。
实验步骤
1. 取被检血清作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32稀释,同时稀释热凝聚IgG,并设缓冲液对照。
3. 取细沉淀管,各管加氯化铯溶液约10μl,上层加各种稀释血清,3000r/min离心10min
4. 取出,对着黑色背景观察,在两液交界,如出现白色沉淀环即为免疫复合物阳性。热凝聚IgG对照也应出现不同程度的沉淀环,缓冲液对照不出现环状沉淀。
全部免疫复合物检测阳性对照,均可用热凝聚IgG,其制备方法如下。
1. 取Cohn’sFⅡ球蛋白(或纯化IgG)1g,溶解于100ml 0.15mol/L生理盐水中,放室温2~3h。
3. 分次(每次1g)缓慢加入67gNa2 SO4 ,放4℃ 1h。
5. 将沉淀物溶解在适当的缓冲液中(如CFD缓冲液,C1q缓冲液等),并用相同的缓冲液透析一昼夜。最后稀释至含蛋白量约为12~15mg/ml,保存于-20℃备用,用时将蛋白含量稀释至1mg/ml。