已经跑了 35 个循环，条带仍然很弱，要继续加循环吗？

晨光微曦

2013-01-30

自己设计了一个引物转录后测试温度梯度的时候，用了之前提取的癌细胞 cDNA，30 个循环后条带非常亮。然后选择了最亮的 59 度 Tm，用正常细胞的 cDNA 来跑 PCR，相同的反应条件下，30 个循环条带很不明显。做到 35 个循环时，六个样本的条带出了五个，但只有一个比较清晰，另外四个要仔细才能看得见。请问：在这种情况下，要继续加循环数目提高么？另外像这种分子表达量比较低的情况下，做 western 会不会不容易出条带（蛋白浓度估计也不高）？

2 个回答

86964109

2013-01-31

有帮助

一般循环可以加到40个的，可能有突变，不过又不用测序

我是金博士

2013-01-30

有帮助

1、你之前提取的是癌细胞的cDNA，摸索出来的条件又以正常细胞cDNA为模板做PCR，这个有可适用性吗？模板都变了。为何不以正常cDNA为模板，摸索条件，再选取最佳条件呢？如果正常cDNA实在不好提取或者比较贵重，那我个人认为，PCR成功的关键引物最重要，其他的Tm，还有循环数都不是最重要的，有必要check下你的引物设计是否过关。 2、很多人做western都不容易出条带，有问题的原因各种各样，但做成功的理由总是类似的，不放过任何细节。一步一步扎扎实实地做。祝你成功。