用循环测序法检测突变实验

相关实验：用循环测序法检测突变实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

血液或者其他来自待测个体的 DNA 材料
乙酸钠异丙醇 TE 缓冲液分子质量标记物寡聚核苷酸测序引物多聚核苷酸激酶反应缓冲液多聚核苷酸激酶双脱氧核苷酸 Taq DNA 聚合酶 10 X 循环测序反应缓冲液矿物油终止液
热循环仪和管子

步骤

1 . 使用标准方法分离纯化人类基因组 D N A (如附录 3 A ，单元 9. 8 和单元 10. 4) ，最后一步是在水或 T E 缓冲液中重悬 D N A 。每循环测序反应只需要 10〜 20f m d D N A 模板（附录 3D D N A 定量方法）。使用如下方法可以很容易地计算出 D N A 双链（组成 IOfmol D N A 模板）的数量： n g D N A 模板 = 1 0 f m o l X i V X 6. 6X 10-3, 其中的 JV是测序模板碱基对的数量。 2 . 准备一个待测序的 D N A 模板， P C R 扩增感兴趣的 D N A 基因组片段，如单元 7 . 1 中描述。_ 3.在 50； xl的 P C R 反应中加入50W 的 5mol/L 乙酸钠， pH4. 8 和 100^1纯异丙醇。室温孵化 lOmin。室温下最大速度（16 OOOg) 微量离心IOmin。弃上清，自然干燥。 4 . 颗粒于 5 0 M 水或 T E 缓冲液中重悬（ PH7.4 ) 。通过分析每琼脂糖上样量并与已知结果的标签（如 lyg <DX-1 7 4 质粒消化 H a e m ) 进行比对计算出重悬 D N A 的数量。 5 . 准备 25^x1引物标记反应，混合体系包括： 12. 5pmol寡核苷酸序列引物；

2. 5/xl 10X T 4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液； I.Oyl 5U / V T 4 多聚核苷酸激酶（共 5u ); 3. 0/xl IOpl Ci/W [y-32P] ATP 或 [7-33P ] A T P (共 3〇 a ) 或 [ > 35S] ATP (共 20ptCi); 加水至25yl。 2. Ojul IOjLtl Ci/jLtl 测序引物立即在5S 丨被导人序列巾殺光显示出突变位点。可以使用 p C R 引物或嵌套引物。因为只有一个引物是有用的，扩增是线性的，不是指数的。 6. 对于每一个D N A 模板，准备 4 个热力管，分别加入知丨下列试剂：■ 声〇1/L ddGTP、 6 ( % mol/L ddATP、 l〇〇〇 pm 〇 l/L ddTTP 或 600jumol/L ddCTP 冰浴储存。 7. 准备测序用的体系储存在一个新的管子中： 10〜20fmol序列模板（第 5 步得到的D N A 溶液）； 1^1 5 端标记的测序引物（从第6 步中得到）； IOX循环测序反应缓冲液； Ijl J 2U/jul Tag D N A 聚合酶（共 2U ); 加水至30juJ。分别向4 个测序管中加入7 4 的体系等份试样（第 6 步所准备的）。对于富含 G C 的模板中， d G T P 能够被7-deaza-d G T P 所取代，以最小化序列表达。 8. 加矿物油（如有必要）。关闭管帽，启动热循环。循环条件根据不同的模板、测序引物、热循环设计有所不同。以标准P C R 条件开始，通过改变反应温度、循环时间和循环次数来优化测序反应（ C P M B 单元15.1)。标准的P C R 程序基本上包括3 0 个循环，其温度分别为94°C 、 55°C 、 72°C 。每个温度持续的时间不相同，如在 Perkin-Elmer Cetus 4800热循环中分别为lmin、 lmin、 2min; 而在 Perkin-Elmer Cetus 9600 或 MJ Research PTC-200 中则分别为 15s、 15s、 30so 9. 热循环结束后，在每个反应管中加5^1溶液停止循环，并在95°C 热变性5min，然后在<4°C 的环境中迅速冷却。 10. 分析循环后的产物用6 % 或 8 % 的聚丙烯酰胺凝胶电泳装载5fjj 变性产物，然后按照要求尽可能快地跑胶。当同时扫描不同个体的D N A 样本时，把 G 反应同时点在胶上（紧接A .T .C 反应之后），使确定突变更为容易。 11. 干胶，在自显影仪上过夜。

来源：丁香实验

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