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    用循环测序法检测突变实验

    相关实验：用循环测序法检测突变实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    血液或者其他来自待测个体的 DNA 材料
    乙酸钠 异丙醇 TE 缓冲液 分子质量标记物 寡聚核苷酸测序引物 多聚核苷酸激酶反应缓冲液 多聚核苷酸激酶 双脱氧核苷酸 Taq DNA 聚合酶 10 X 循环测序反应缓冲液 矿物油 终止液
    热循环仪和管子

    步骤

    1 . 使 用 标 准 方 法 分 离 纯 化 人 类 基 因 组 D N A (如 附 录 3 A ，单 元 9. 8 和 单 元 10. 4) ，最 后 一 步 是 在 水 或 T E 缓 冲 液 中 重 悬 D N A 。 每 循 环 测 序 反 应 只 需 要 10〜 20f m d D N A 模 板 （ 附 录 3D D N A 定 量 方 法 ） 。 使 用 如 下 方 法 可 以 很 容 易 地 计 算 出 D N A 双 链 （ 组 成 IOfmol D N A 模 板 ） 的 数 量 ： n g D N A 模 板 = 1 0 f m o l X i V X 6. 6X 10-3, 其 中 的 JV是 测 序 模 板 碱 基 对 的 数 量 。 2 . 准 备 一 个 待 测 序 的 D N A 模 板 ， P C R 扩 增 感 兴 趣 的 D N A 基 因 组 片 段 ，如 单 元 7 . 1 中 描述。_ 3.在 50； xl的 P C R 反应中加入50W 的 5mol/L 乙酸钠， pH4. 8 和 100^1纯异丙醇。室 温 孵 化 lOmin。室温下最大速度（16 OOOg) 微量离心IOmin。弃 上清， 自 然干燥。 4 . 颗 粒 于 5 0 M 水 或 T E 缓 冲 液 中 重 悬 （ PH7.4 ) 。通 过 分 析 每 琼 脂 糖 上 样 量 并 与 已 知 结 果 的 标 签 （ 如 lyg <DX-1 7 4 质 粒 消 化 H a e m ) 进 行 比 对 计 算 出 重 悬 D N A 的 数量。 5 . 准 备 25^x1引 物 标 记 反 应 ，混 合 体 系 包 括 ： 12. 5pmol寡 核 苷 酸 序 列 引 物 ；
    2. 5/xl 10X T 4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液； I.Oyl 5U / V T 4 多聚核苷酸激酶（ 共 5u ); 3. 0/xl IOpl Ci/W [y-32P] ATP 或 [7-33P ] A T P (共 3〇 a ) 或 [ > 35S] ATP (共 20ptCi); 加水至25yl。 2. Ojul IOjLtl Ci/jLtl 测 序 引 物 立即在5S 丨被导人 序 列 巾 殺 光 显 示 出 突 变 位 点 。 可 以 使 用 p C R 引 物 或 嵌 套 引 物 。因为只有 一 个 引 物 是 有 用 的 ，扩 增 是 线 性 的 ，不 是 指 数 的 。 6. 对于每一个D N A 模板，准 备 4 个热力管，分别加入知丨下 列 试剂：■ 声 〇1/L ddGTP、 6 ( % mol/L ddATP、 l〇〇〇 pm 〇 l/L ddTTP 或 600jumol/L ddCTP 冰浴 储存。 7. 准备测序用的体系储存在一个新的管子中： 10〜20fmol序列模板（ 第 5 步得到的D N A 溶液） ； 1^1 5 端标记的测序引物（ 从第6 步中得到） ； IOX循环测序反应缓冲液； Ijl J 2U/jul Tag D N A 聚 合 酶 （ 共 2U ); 加水至30juJ。 分别向4 个测序管中加入7 4 的体系等份试样（ 第 6 步所准备的） 。对于富含 G C 的模板中， d G T P 能够被7-deaza-d G T P 所取代，以最小化序列表达。 8. 加矿物油（ 如有必要） 。关闭管帽，启动热循环。循环条件根据不同的模板、测序引 物、热循环设计有所不同。以标准P C R 条件开始，通过改变反应温度、循环时间和 循环次数来优化测序反应（ C P M B 单元15.1)。 标准的P C R 程序基本上包括3 0 个循环，其温度分别为94°C 、 55°C 、 72°C 。每 个温度持续的时间不相同，如 在 Perkin-Elmer Cetus 4800热循环中分别为lmin、 lmin、 2min; 而在 Perkin-Elmer Cetus 9600 或 MJ Research PTC-200 中则分别为 15s、 15s、 30so 9. 热循环结束后，在每个反应管中加5^1溶液停止循环，并在95°C 热变性5min，然后 在<4°C 的环境中迅速冷却。 10. 分析循环后的产物用6 % 或 8 % 的聚丙烯酰胺凝胶电泳装载5fjj 变性产物，然后按照 要求尽可能快地跑胶。当同时扫描不同个体的D N A 样本时，把 G 反应同时点在胶 上 （ 紧接A .T .C 反应之后） ，使确定突变更为容易。 11. 干胶，在自显影仪上过夜。

    来源：丁香实验

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