相关实验：用循环测序法检测突变实验
最新修订时间：2024-05-13
材料与仪器
步骤
来源：丁香实验
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问
B细胞V区突变检测
测序出现这种情况正常吗
求助:DD/DI/II在DNA测序图上怎么看呀
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![2. 5/xl 10X T 4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液； I.Oyl 5U / V T 4 多聚核苷酸激酶（ 共 5u ); 3. 0/xl IOpl Ci/W [y-32P] ATP 或 [7-33P ] A T P (共 3〇 a ) 或 [ > 35S] ATP (共 20ptCi); 加水至25yl。 2. Ojul IOjLtl Ci/jLtl 测 序 引 物 立即在5S 丨被导人 序 列 巾 殺 光 显 示 出 突 变 位 点 。 可 以 使 用 p C R 引 物 或 嵌 套 引 物 。因为只有 一 个 引 物 是 有 用 的 ，扩 增 是 线 性 的 ，不 是 指 数 的 。 6. 对于每一个D N A 模板，准 备 4 个热力管，分别加入知丨下 列 试剂：■ 声 〇1/L ddGTP、 6 ( % mol/L ddATP、 l〇〇〇 pm 〇 l/L ddTTP 或 600jumol/L ddCTP 冰浴 储存。 7. 准备测序用的体系储存在一个新的管子中： 10〜20fmol序列模板（ 第 5 步得到的D N A 溶液） ； 1^1 5 端标记的测序引物（ 从第6 步中得到） ； IOX循环测序反应缓冲液； Ijl J 2U/jul Tag D N A 聚 合 酶 （ 共 2U ); 加水至30juJ。 分别向4 个测序管中加入7 4 的体系等份试样（ 第 6 步所准备的） 。对于富含 G C 的模板中， d G T P 能够被7-deaza-d G T P 所取代，以最小化序列表达。 8. 加矿物油（ 如有必要） 。关闭管帽，启动热循环。循环条件根据不同的模板、测序引 物、热循环设计有所不同。以标准P C R 条件开始，通过改变反应温度、循环时间和 循环次数来优化测序反应（ C P M B 单元15.1)。 标准的P C R 程序基本上包括3 0 个循环，其温度分别为94°C 、 55°C 、 72°C 。每 个温度持续的时间不相同，如 在 Perkin-Elmer Cetus 4800热循环中分别为lmin、 lmin、 2min; 而在 Perkin-Elmer Cetus 9600 或 MJ Research PTC-200 中则分别为 15s、 15s、 30so 9. 热循环结束后，在每个反应管中加5^1溶液停止循环，并在95°C 热变性5min，然后 在<4°C 的环境中迅速冷却。 10. 分析循环后的产物用6 % 或 8 % 的聚丙烯酰胺凝胶电泳装载5fjj 变性产物，然后按照 要求尽可能快地跑胶。当同时扫描不同个体的D N A 样本时，把 G 反应同时点在胶 上 （ 紧接A .T .C 反应之后） ，使确定突变更为容易。 11. 干胶，在自显影仪上过夜。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469756141041qte93bvec3png_small.jpg)
