互联网2013-11-13
多胺是所有活细胞内的脂质阳离子小分子化合物，以腐胺、精脒和精胺为主要代表。已揭示在某些重要的生物过程中，例如DNA、RNA和蛋白质的合成中，多胺可能具有一定的作用。但其作用机制目前还不够明确。本试验通过多胺体外结合蛋白的分析，来鉴别和描述新型多胺。本文采取超滤方法，分析多胺（精胺或胺）结合大肠杆菌或酿酒酵母产生的人或鸟的鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白。除了方便，快捷，此方法只需少量纯化的蛋白检测多胺的结合。
1．缓冲液（50mLTris-HCl，pH值7.8，4°C保存）
2．[3H]-精胺（(PerkinElmer，编号：NET522001MC）
3．[14C]-精胺（GE Healthcare，编号：CFA511）
4．6His-OAZ1（酿酒酵母）IMAC洗脱缓冲液（50mLTris-HCl，pH值7.8，含250mL咪唑）
5．大肠杆菌的模拟准备大肠杆菌细胞转化空载体表达的6His-OAZ1。
6． Scintillation液（(picard）
7．离心管（Eppendorf公司）
1．所有试剂置于冰上，离心机调至4°C。 2．标记离心管，预冷于冰上。 3．将多胺结合液分装于离心管，并标记A、B区分不同成分，预冷于冰上。 4．轻轻混合多胺结合液，孵育冰上60min。 5．将过滤装置放于1.5mL收集管中，冰上预冷。 6．经过60min的孵育时间，转移100μL多胺结合液于过滤装置。 7．纺纱2500xg过滤，5min，4°C。 8．准备含1 mL闪烁液的离心管（每次过滤准备2个含闪烁液的离心管），并保持在室温。 9．从内部切断过滤装置取出10μL滞留物，将其加入含闪烁液的离心管中，标记为“滞留物”。 10．从收集管中取出10μL滤液，加入含闪烁液的离心管中，标记为“滤液”。 11．离心10S，进行闪烁计数。 12．从CPM值（每分钟计数），利用如下公式计算多胺结合蛋白的百分比。 多胺结合百分比= {（滞留物的CPM-滤液的CPM）/滞留物的CPM }×100
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