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超滤法检测体外多胺结合蛋白的分析

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实验原理

多胺是所有活细胞内的脂质阳离子小分子化合物,以腐胺、精脒和精胺为主要代表。已揭示在某些重要的生物过程中,例如DNA、RNA和蛋白质的合成中,多胺可能具有一定的作用。但其作用机制目前还不够明确。本试验通过多胺体外结合蛋白的分析,来鉴别和描述新型多胺。本文采取超滤方法,分析多胺(精胺或胺)结合大肠杆菌或酿酒酵母产生的人或鸟的鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白。除了方便,快捷,此方法只需少量纯化的蛋白检测多胺的结合。

实验试剂

1.缓冲液(50mLTris-HCl,pH值7.8,4°C保存)

2.[3H]-精胺((PerkinElmer,编号:NET522001MC)

3.[14C]-精胺(GE Healthcare,编号:CFA511)

4.6His-OAZ1(酿酒酵母)IMAC洗脱缓冲液(50mLTris-HCl,pH值7.8,含250mL咪唑)

5.大肠杆菌的模拟准备大肠杆菌细胞转化空载体表达的6His-OAZ1。

6. Scintillation液((picard)

7.离心管(Eppendorf公司)

实验步骤

1.所有试剂置于冰上,离心机调至4°C。

2.标记离心管,预冷于冰上。

3.将多胺结合液分装于离心管,并标记A、B区分不同成分,预冷于冰上。

4.轻轻混合多胺结合液,孵育冰上60min。

5.将过滤装置放于1.5mL收集管中,冰上预冷。

6.经过60min的孵育时间,转移100μL多胺结合液于过滤装置。

7.纺纱2500xg过滤,5min,4°C。

8.准备含1 mL闪烁液的离心管(每次过滤准备2个含闪烁液的离心管),并保持在室温。

9.从内部切断过滤装置取出10μL滞留物,将其加入含闪烁液的离心管中,标记为“滞留物”。

10.从收集管中取出10μL滤液,加入含闪烁液的离心管中,标记为“滤液”。

11.离心10S,进行闪烁计数。

12.从CPM值(每分钟计数),利用如下公式计算多胺结合蛋白的百分比。

多胺结合百分比= {(滞留物的CPM-滤液的CPM)/滞留物的CPM }×100

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