体外细胞核连缀反应产物的分析

环状质粒 DNA
氢氧化钠 SSPE 预杂交缓冲液
狭线印迹装置

一、狭线印迹的制备

1. 如果用的是环状质粒 DNA，用适当的限制酶使 DNA 探针线性化。每个狭线需用 5 μg DNA。

2. 往线性 DNA 溶液中加氢氧化钠至 0.1 mol/L，混匀，室温放置 30 分钟使 DNA 变性。加 1.5 倍体积 6xSSPE 置于冰上中和。中和后的 DNA 浓度应接近于 10 μg/ml。

3. 按说明书装配印迹装置，往狭线印迹装置的加样孔内加 0.5 ml（5 μg）已中和的变性 DNA，30 秒内以足够的真空抽干加样孔。

4. 以同样的真空条件，用 0.5 ml 6xSSPE ( 或说明书推荐的合适的盐溶液）洗涤加样孔两次。

5. 取出滤膜，用铅笔或记号笔在狭线处做上记号，然后依照说明书将 DNA 交联在滤膜上。

二、细胞核连缀反应产物的杂交分析

1. 每 100 cm² 滤膜加 20 ml 预杂交缓冲液，于 37℃ 预杂交 4~18 小时。

2. 加热溶于 TE 缓冲液的标记的核 RNA 至 65℃ 以破除二级结构，然后制备杂交溶液。标记 RNA 的用量取决于滤膜的表面积。

3. 倒去预杂交液，加入最小量的杂交缓冲液（即 3~5 ml/100 cm² 膜表面积）。

4. 37℃ 杂交。

5. 孵育结束后，除去杂交液，将滤膜放入清洗容器。

6. 用大量（每次 200 ml）逐渐严紧的系列缓冲液冲洗来结合的标记 RNA。缓冲液使用次序如下：

1x SSPE，0.2% SDS，60℃，4 次，每次 15 分钟；

0.2x SSPE，0.2% SDS，60℃，2 次，每次 15 分钟；

2x SSPE，室温，2 次，每次 15 分钟；

2x SSPE，10 mg/ml RNA 酶A，37℃，30 分钟；

2x SSPE，0.2% SDS，37℃，2 次，每次 10 分钟。

7. 冲洗与 RNA 酶 A 处理后，将滤膜放在干净的 Whatman 滤纸上吸干，盖上塑料薄膜，然后放射自显影或磷光成像。