材料与仪器
组织
EDTA SDS 蛋白酶 K
玻璃试管
EDTA SDS 蛋白酶 K
玻璃试管
步骤
1. 融解从 1 g 组织或 5 瓶培养皿细胞制备、冻存于 NSB 中的细胞核。1000 g 离心 5 分钟，去上清，用 200 μl HRB 轻轻吹打重悬。
2. 将悬液转至一个带有抗酚螺帽的硅化玻璃试管，37℃ 水浴 5 到 15 分钟（由预实验决定)。孵育过程中，偶尔轻轻搅动细胞核，避免沉于管底。
3. 加入 1.5 ml HSB 和 90 μl DNA 酶Ⅰ（终浓度 100 单位/ml）终止反应，37℃ 水浴 3~5 分钟，同时剧烈吹打直至不再黏稠。
4. 依次加入 40 μl 0.5 mol/L EDTA，40 μl 25% SDS 与 20 mg/ml 蛋白酶 K，混匀，37℃ 水浴 30 分钟。
5. 热酸酚抽提除去蛋白质和大部分 DNA：加 2.5 ml 抽提缓冲液，然后加等量预热到 65℃ 的由抽提缓冲液饱和的酚，于 65℃ 剧烈混合 10 分钟。
6. 将试管置于冰上 5 分钟，然后于 2000 g 离心 15 分钟分离水相与有机相。吸去下层有机相，留下水相于界面。
7. 加等量新鲜饱和酚，如第 5 步再抽提一次。
8. 将水相吸出到一个新离心管，用等量氯仿抽提一次。将上层水相吸出到一个新离心管。
9. 加 100 μg 酵母 tRNA 载体与 2.5 倍体积冰冷的乙醇，于 -20℃ 放置 1 到 18 小时沉淀 RNA。
10. 10000 r/min 离心 10 分钟，去上清，再用 1 ml TE 缓冲液重悬。
11. 如果 RNA 用作滤膜杂交的探针，最好做（也可不做）一步额外的清洗。
(1) 往第 10 步得到的 1 ml RNA 样品中加 1 ml 冰冷的 10% TCA，冰浴 10 分钟以沉淀 RNA。
(2) 合适的收集装置（如微孔滤器），通过真空抽滤将沉淀收集于一张直径 25 mm 的硝酸纤维素滤膜上，在滤器中用冰冷的乙醇清洗滤膜。
(3) 将滤膜放在一个硅化玻璃液闪计数管的底部，于 65℃ 分 2~3 次各用 1 ml 水冲洗，合并收集冲洗液。
(4) 乙醇沉淀浓缩 RNA ( 即加甲酸钠至 0.2 moI/L，加二倍体枳乙醇，于 10000 r/min 离心 10 分钟）或用真空离心蒸发干燥器浓缩 RNA。
2. 将悬液转至一个带有抗酚螺帽的硅化玻璃试管，37℃ 水浴 5 到 15 分钟（由预实验决定)。孵育过程中，偶尔轻轻搅动细胞核，避免沉于管底。
3. 加入 1.5 ml HSB 和 90 μl DNA 酶Ⅰ（终浓度 100 单位/ml）终止反应，37℃ 水浴 3~5 分钟，同时剧烈吹打直至不再黏稠。
4. 依次加入 40 μl 0.5 mol/L EDTA，40 μl 25% SDS 与 20 mg/ml 蛋白酶 K，混匀，37℃ 水浴 30 分钟。
5. 热酸酚抽提除去蛋白质和大部分 DNA：加 2.5 ml 抽提缓冲液，然后加等量预热到 65℃ 的由抽提缓冲液饱和的酚，于 65℃ 剧烈混合 10 分钟。
6. 将试管置于冰上 5 分钟，然后于 2000 g 离心 15 分钟分离水相与有机相。吸去下层有机相，留下水相于界面。
7. 加等量新鲜饱和酚，如第 5 步再抽提一次。
8. 将水相吸出到一个新离心管，用等量氯仿抽提一次。将上层水相吸出到一个新离心管。
9. 加 100 μg 酵母 tRNA 载体与 2.5 倍体积冰冷的乙醇，于 -20℃ 放置 1 到 18 小时沉淀 RNA。
10. 10000 r/min 离心 10 分钟，去上清，再用 1 ml TE 缓冲液重悬。
11. 如果 RNA 用作滤膜杂交的探针，最好做（也可不做）一步额外的清洗。
(1) 往第 10 步得到的 1 ml RNA 样品中加 1 ml 冰冷的 10% TCA，冰浴 10 分钟以沉淀 RNA。
(2) 合适的收集装置（如微孔滤器），通过真空抽滤将沉淀收集于一张直径 25 mm 的硝酸纤维素滤膜上，在滤器中用冰冷的乙醇清洗滤膜。
(3) 将滤膜放在一个硅化玻璃液闪计数管的底部，于 65℃ 分 2~3 次各用 1 ml 水冲洗，合并收集冲洗液。
(4) 乙醇沉淀浓缩 RNA ( 即加甲酸钠至 0.2 moI/L，加二倍体枳乙醇，于 10000 r/min 离心 10 分钟）或用真空离心蒸发干燥器浓缩 RNA。
来源：丁香实验
