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来氟米特水溶液化学稳定性的研究

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  摘要目的:研究广泛pH范围内来氟米特的化学稳定性。方法:建立来氟米特的HPLC测定方法,测定不同温度下不同pH值时来氟米特分解的速度常数,得到不同pH值时的分解活化能及不同温度下的最稳定pH值。结果:常温(20~40℃)下来氟米特最稳定的pH范围是2.85~4.56,活化能数值恰在此范围内出现极大值。最稳定的pH范围随温度升高而向低pH值方向移动,当温度大于60℃时,最稳定pH值为1.80以下。结论:适当调整溶液的pH值可以显著改善来氟米特的化学稳定性,为其制剂学研究提供了部分依据。

  来氟米特(leflunomide,LFM)是新型的具有抗炎及免疫抑制作用的异�唑类衍生物,其作用机制不同于已知的其他抗炎及免疫抑制药物,对多种自身免疫性疾病有治疗作用。Ⅱ期临床试验显示LFM治疗类风湿性关节炎效果显著,现正在欧、美进行Ⅲ期临床试验。但LFM是一种前体药物,在人及动物体内转化成活性开环代谢物A771726,使LFM水溶液呈不稳定性,关于其分解的活化能(E)及最稳定pH值的研究未见报道。我们采用经典恒温法对LFM水溶液的化学稳定性进行研究,以反相HPLC法测定其含量,为新药LFM的制剂学研究提供理论依据。

  1、材料和方法

  1.1仪器和试药WatersMaxima820系统,包括Waters510泵,Waters486可变波长紫外检测器,U6K进样器(美国Waters公司);UV-2100型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);CS501型超级恒温器(重庆实验设备厂);pHS-3D型pH计(上海三信仪表厂)。LFM(药物合成室提供);萘(色谱纯,上海试剂一厂);甲醇(色谱纯,上海化学试剂研究所)。其他试剂均为分析纯。

  1.2LFM供试液的配制实验在pH1.80~7.34内进行,约每隔1pH单位作一个数据点。缓冲液按英国药典(1993年版)方法配制,pH1.80~4.56用醋酸盐,pH5.88~7.34用磷酸盐,pH精确度±0.03。配制一定pH值的15.28μg/mlLFM溶液,立即封装于2ml安瓿。

  1.3加速实验将供试液立即置于恒温水浴中,定时取样,每次10支,冰箱骤冷,终止反应,打碎混匀。加速实验温度为66,71,77,82及87℃,温度控制±0.5℃。

  1.4LFM的含量测定方法

  1.4.1色谱条件色谱柱ODSC18柱(4.6mm×150mm,10μm,大连化学物理研究所),流动相为甲醇∶水∶磷酸(67∶33∶0.006),流速1.0ml/min,检测波长260nm,灵敏度0.01AUFS,萘为内标,进样量20μl。

  1.4.2标准曲线的制备准确配制质量浓度为16.4μg/ml的萘储备液和质量浓度为38.2μg/ml的LFM储备液。精密量取LFM储备液0.025,0.050,0.100,0.250,0.500,1.000,2.000ml至10ml量瓶中,加入萘储备液1.000ml,用流动相稀释成0.0955,0.191,0.382,0.955,1.91,3.82,7.64μg/ml的标准液。以LFM的质量浓度(ρ)对其与内标的峰面积比(R)进行回归,得标准曲线方程ρ=-0.0020+0.6989R,r=0.9999(n=7)。

  1.4.3供试液的含量测定精取供试液0.2ml,加内标萘储备液0.1ml,用流动相稀释至1.0ml,进样测定。

  2、结果

  2.1不同pH值时的Arrhenius方程实验得到不同pH时各温度下的分解速度常数k值,用lgk对1/T(T为热力学温度)回归,得Arrhenius方程,并根据方程计算出不同pH值的分解活化能E及248K(25℃)的t1/2。

  2.2不同pH值时不同温度下的速度常数k根据Arrhenius方程推算出不同pH值时20,40,60,70,80及90℃下的速度常数k,作lgk-pH图,见图3。常温(20~40℃)下反应速度常数k出现极小值的pH值是2.85~4.56,LFM的分解活化能数值亦在此范围内出现极大值,此点符合化学反应动力学的一般情况,即Arrhenius方程中指前因子A(亦称频率因子)相近时,活化能高,反应速度小。LFM的分解反应速度随温度升高而加剧,稳定的pH值范围随温度升高而向低pH值方向移动,当温度大于60℃时,最稳定pH值为1.80以下。

  3、讨论

  LFM的含量测定方法国内未见报道,国外报道可采用HPLC法测定,但不详细。本研究选用在LFM最大吸收峰260nm附近也有较强紫外吸收的萘为内标,适当调整流动相的比例,内标萘的保留时间约9.11min,LFM的保留时间约5.92min,两峰分离完全,无杂质干扰峰,检测限达0.8ng,日内偏差和日间偏差分别为0.76%(n=5)和0.86%(n=5),方法回收率为99.66%(RSD=0.80%)。降解产物A771726的最大吸收波长在290nm附近,该实验条件下未出现其他的色谱峰,不干扰LFM的测定,我们将在以后的实验中建立A771726的含量测定方法。本法的建立为进一步开展LFM的制剂学、药代动力学、药效学等的研究提供了一种简便、可靠的分析手段。

  有关LFM水溶液的稳定性研究,由于专利或新药保护等问题,国外未见有类似文献报道。本实验发现LFM的分解是受pH值影响的一级反应,其分解活化能与pH值有关。但在pH1.80时,指前因子A和活化能E都特别小,此时活化能与其他pH值条件下的活化能不具可比性。由于活化能所反映的是速度常数k随温度T的变化率(dlnk/dT=E/RT2),pH1.80时k随温度T的变化率最小,因而此时活化能亦最小,这同时说明pH1.80条件下LFM的稳定性受温度的影响最小。总之,就温度而言,LFM水溶液的最稳定pH值可取1.80或更低;但就样品的常温贮存和实验操作的一般要求而言,LFM水溶液的最稳定pH值可取2.85~4.56,此时溶液的t1/2最长。实验过程中曾对LFM在较强碱性条件下的稳定性作过观察,因其分解迅速而未做进一步的研究。

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