反相高效液相色谱法测定尿液4种肾病标志物

　　Reversedphase high performance liquid chromatography assay for determining 4 kinds of markers of diabetic nephropathy in urine

　　【Abstract】 AIM: To establish a new reversedphase high performance liquid chromatography (RPHPLC) method for assay 4 kinds of nonproteinnitrogen markers of human diabetic nephropathy (DN),  creatine (Cr), creatinine (Cn), urea (U) and uric acid (Ua) in DN patients urines. METHODS: The urine samples were assayed by RPHPLC on C18 column (200 mm×4.6 mm, id 5 μm) at the ambient temperature and a wave length of 200 nm, using a 10 mmol/L pH 6.86 phosphate buffer ［consisted 30%(V/V) methanol］ as mobile phase with the flow rate of 0.9 mL/min. RESULTS: Baseline separation of the urine could be easily achieved in 5 min after a simple sample preparation. The method also displayed a high reproducibility (RSD values of retention time and peak area were no more than 3%) and the calibration curves showed good linearities in the range of 5-300 μmol/L, 10-200 μmol/L, 1-30 μmol/L, 10-1500 μmol/L for Cr, Cn, U and Ua respectively. CONCLUSION: This method has great potential for routine assay of clinical urine samples and monitoring DN early.

　　【Keywords】 reversed high performance liquid chromatography; diabetic nephropathy; nonprotein nitrogen; urine

　　【摘要】 目的：建立糖尿病患者尿液中与肾病相关的非蛋白氮代谢产物(肌酸、肌酐、尿素和尿酸)的反相高效液相色谱分离分析方法. 方法：采用Agilent C18（200 mm×4.6 mm, 内径5 μm）色谱柱，流动相含30％(体积比)甲醇和10 mmol/L，pH 6.86的磷酸缓冲溶液，流速0.9 mL/min，检测波长200 nm，柱温为室温. 结果：在5 min内可对患者尿液中上述4种物质同时进行测定，样品前处理简单，重现性较好(迁移时间和峰面积的RSD均≤3%)，线性范围较宽（肌酸：5~300 μmol/L, 肌酐：10~200 μmol/L, 尿素：1~30 mmol/L, 尿酸：10~1500 μmol/L）. 结论：此法完全适用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测.

　　【关键词】 反相高效液相色谱；糖尿病肾病；非蛋白氮；尿样

　　0引言

　　糖尿病并发肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病患者致死的重要原因之一，已引起了人们的广泛关注. 非蛋白氮代谢产物如肌酸(creatine, Cr)、肌酐(creatinine, Cn)、尿素(urea, U)和尿酸(uric acid, Ua)即是与DN相关的几种物质. 已报道的有关这些物质的分离分析方法主要有比色法［1］、酶法［2］、液相色谱法［3-6］、毛细管电泳法［7-9］等. 其中比色法和酶法通常只能测定单一的物质，而且尿液中的一些内源性物质对测定有干扰；液相色谱法则多集中在对某一种或部分物质的测定上；毛细管电泳测定这些标志物重现性有待于提高. 我们运用反相高效液相色谱法，对DN患者尿液中与DN相关的Cr, Cn, U和Ua这4种非蛋白氮代谢产物进行同时分离检测. 同时测定尿液中的4种物质目前还未见报道. 此法具有快速、灵敏度高和重现性好的特点，完全可运用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测.

　　1材料和方法

　　1.1材料Agilent 1100液相色谱仪（美国Agilent公司）；Cr，Cn，Ua均购自Sigma公司（USA，Sigma）；甲醇为色谱纯试剂（天津第二化学试剂厂）；其余试剂均为分析纯，水为二次重蒸水.

　　1.2方法

　　1.2.1色谱条件色谱柱为Agilent C18柱（200 mm×4.6 mm,内径5 μm），流动相含体积比为30%的甲醇和10 mmol/L，pH 6.86的磷酸缓冲溶液，等度洗脱，流速0.9 mL/min，检测波长200 nm，柱温为室温，进样量为10 μL.

　　1.2.2标准溶液的配置和尿样的处理方法Cr, Cn和U标准溶液均使用二次重蒸水配置成一定的浓度. Ua溶液的配置方法如下：取30 mg磷酸钾，溶解在40 mL重蒸水中，加热至60℃，使其完全溶解，精确称取Ua 28 mg,溶解于热磷酸钾溶液中，冷却至室温，移入100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，贮存在棕色瓶中保存. 尿液样品的处理方法：取新鲜的尿液用水稀释1倍后待用. 所有溶液每周更换1次，使用前均过0.45 μm的水相膜后再用于色谱分析.

　　2结果

　　2.1色谱条件的优化固定其它色谱条件不变，分别改变缓冲液的pH值、流动相（pH 6.86）中甲醇比例、流动相中缓冲液浓度和流动相的流速，考察了其对4种物质分离的影响. 四种物质的分离随pH、甲醇比例、磷酸缓冲液浓度和流动相的流速的变化情况分别如图1，2所示.

　　A：流动相pH；B：甲醇比例.

　　图1流动相pH和甲醇比例对几种标志物保留时间的影响（略）

　　A：磷酸缓冲液浓度；B：流速. R12: U和Cr之间的分离度; R23: Cr和Ua之间的分离度; R34: Ua和Cn之间的分离度.

　　图2流动相中磷酸缓冲液浓度以及流速对分离的影响（略）

　　2.2方法重现性在选定的色谱条件下，连续5次测定了同一样品，对各物质的迁移时间、峰面积和峰高的重现性进行了考察，结果表明,各物质的迁移时间的变化很小（保留时间的RSD值见表1），方法的重现性较好.
2.3定量标准曲线、回收率以及最低检测限配置一系列浓度的标准溶液，按上述色谱条件进行分析测定，将所测的峰面积对物质的浓度作回归分析，其线性相关系数均大于0.9992；以信噪比(S/N)为3来测定检测限；添加已知量标样，测定其含量，计算方法的回收率(表1).

　　表1方法的相关参数（略）

　　2.4样品分析在选定的色谱条件下，对标准溶液和实际DN尿样进行了分析，5 min内4种物质即可达到完全分离，分离结果如图3所示，实际DN尿样中的4种物质得到了很好的检出，尿样里的其他物质对分析无干扰. 采用此法对某糖尿病患者以及正常人尿样中的Cn, Cr, U，Ua分别进行测定，结果糖尿病患者尿样中Cn, Cr, U，Ua的含量分别为10.3, 0.68, 26.7，2.1 μmol/mL, 正常人尿样中的Cn, U，Ua的含量分别为7.7, 36.7，1.0 μmol/mL,而Cr未被检出.

　　图3标准溶液(A)和尿样(B)的色谱图（略）

　　3讨论

　　3.1pH对分离的影响其从图1A中可以看出，在pH 3.5~7.5范围内U和Cr的出峰时间和顺序几乎不随pH的变化而变化；而对于Cn和Ua来说，其出峰时间和顺序都随pH的变化而变化，当pH接近5.5时，两者的出峰时间近乎相同，得不到分离. 因此，在选择最佳pH时，主要考虑Cn和Ua之间的分离度（Rs）以及分析的效率（分析周期短），最终选择缓冲能力最强，分离度较佳（Rs＝4.1）的pH 6.86为优化的分离pH.

　　3.2流动相中甲醇比例的选择从图1B中可以看出，随着流动相中甲醇比例的增加，各标志物的出峰时间随之减少，分离周期大大缩短，但与此同时各标志物间的分离度也相应减少，当流动相中甲醇的比例大于40％时，各物质几乎同时被洗脱出来，难以达到分离. 最终选择流动相中甲醇含量为30％为较佳的比例（此时分析周期较短，各物质间分离度均大于2.0）.

　　3.3流动相中缓冲液浓度对分离的影响从图2A中可以看出，随着缓冲液浓度的增加，各标志物的峰面积随之减小. 而缓冲液浓度为5和10 mmol/L时峰面积比较接近，最终选择缓冲能力较强的10 mmol/L为最佳缓冲液浓度.

　　3.4流速的优化从图2B中可以看出，当流速从0.4 mL/min增加到0.9 mL/min时，各物质间的分离度是逐渐增加的，并且分析周期变短；而当流速从0.9 mL/min增加到1.0 mL/min后，虽然分析效率有所提高（分离周期从4.8 min减少到4.0 min），但各物质间的分离度却有所减小（此时的柱压也过高：93.1 bar）. 最终选择0.9 mL/min为最佳流速.

　　3.5测定结果的分析从某糖尿病患者以及正常人尿样测定的结果可以看出，Cn，Cr和Ua在糖尿病患者尿样中的含量高于正常人（患者尿样中Cr的含量远远高于正常人尿液中Cr的含量）；而患者尿样中U的含量反而有所降低. 这些都说明患者肾功能已经出现异常，非蛋白氮代谢产物不能很好的排出体外（对Cr的排泄率增加，而U排泄率降低），这也从一个侧面证实了患者的肾脏已经有了一定程度的损坏.

　　传统的分析方法的干扰因素较多，分离效率和灵敏度较差，而采用的此法可在5 min内同时测定糖尿病肾病尿样中的Cn, Cr, U和Ua这4种非蛋白氮代谢产物. 此方法具有快速、需样量小、灵敏度高和重现性好的特点，完全可运用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测.

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