高效液相色谱法测定氢氯噻嗪原料的含量

　　【摘要】 目的：建立氢氯噻嗪原料药的含量测定方法。方法：采用C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1 mol/L磷酸二氢钠�乙腈（9∶1）（用磷酸调节pH值至3.0）为流动相，检测波长271 nm，流速1.5 mL/min，柱温30 ℃。结果：氢氯噻嗪浓度在0.004～0.20 mg/mL浓度范围内与峰面积线性关系良好（r=0.9999，n=7），加样回收率99.82%，RSD=0.98%。结论：该方法专属性强，灵敏度高，重复性好，操作简便，适用于氢氯噻嗪原料的质量控制。

　　【关键词】  氢氯噻嗪 高效液相色谱法 含量测定

　　HPLC Determination of Hydrochlorothiazide

　　ZENG Tan, ZHOU Lin

　　(Chongqing Institute for Drug Control, Chongqing  400121, China)

　　［Abstract］ Objective:To develop an HPLC method for the determination of Hydrochlorothiazide. Methods: The chromatographic separation was performed on a C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) held in the oven of 30 ℃. The mobile phase consisted of a degassed mixture of 0.1 mol/L monobasic sodium phosphate and acetonitrile (9:1), adjusted with phosphoric acid to a pH of 3.0. The flow rate was 1.5 mL/min and UV detection wavelength was 271 nm. Results: The calibration of the responses of hydrochlorothiazide ranged from 0.004 to 0.20 mg/mL with a correlation coefficient of 0.9999, recovery rate of 99.82% and RSD=0.98%. Conclusions: The method proves to be quick, simple and sensitive. It could be applied into the quality control of hydrochlorothiazide.

　　［Key words］ Hydrochlorothiazide; High performance liquid chromatography; Determination of content

　　氢氯噻嗪是一种临床应用十分普遍的药物，主要抑制髓袢升支皮质部对Na+和Cl�的重吸收，使肾脏对氯化钠的排泄增加而产生利尿作用，常与其他降压药物配合作用治疗高血压。原质量标准采用甲醇钠滴定法测定其含量［1］，毒性较大且操作不便，方法精密度差。本研究参考国内外氢氯噻嗪原料的质量标准［2］，建立了氢氯噻嗪含量测定的HPLC方法。

　　1  仪器和试药

　　Agilent 1100高效液相色谱仪（配有紫外检测器及二极管阵列检测器），AE240型电子天平（瑞士梅特勒）。磷酸二氢钠（分析纯，重庆北碚化学试剂厂）、乙腈（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司）、水（二次蒸馏水）、氢氯噻嗪对照品（中国药品生物制品检定所，批号为100309�200702，含量99.8%）。

　　2  方法与结果

　　2.1  测定波长选择

　　取氢氯噻嗪对照品20 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇�乙腈（1∶1）5 mL溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液5 mL置50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，在200～400 nm波长处扫描，扫描结果见图1。由图可见，最大吸收波长为224 nm、271 nm。224 nm波长靠近末端吸收且杂质在此波长处吸收较大，故选择271 nm做为检测波长。

　　图1  氢氯噻嗪紫外扫描图谱（略）

　　2.2  色谱条件及系统适用性实验

　　色谱柱：pHenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1 mol/L磷酸二氢钠溶液�乙腈（9∶1）（用磷酸调节pH值至3.0）；测定波长：271 nm；流速：1.5 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下，氢氯噻嗪峰的保留时间为11.217 min，理论塔板数为19 054，氢氯噻嗪峰与最近杂质峰的分离度为13.58。色谱图见图2。

　　图2  氢氯噻嗪原料色谱图（略）

　　2.3  线性范围

　　精密称取氢氯噻嗪对照品20.00 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇�乙腈（1∶1）5 mL溶解并用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别量取对照品储备液适量，用流动相稀释制成每毫升含0.004、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.20 mg的溶液。照上述色谱条件，分别各取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为x，峰面积为y，计算回归方程为：y=1.5553+24769.1x，r=0.9999（n=7），表明氢氯噻嗪在0.004～0.20 mg/mL浓度范围内与峰面积的线性关系良好。

　　2.4  检测限与定量限

　　取浓度为0.1004 μg/mL的氢氯噻嗪对照品溶液进样10 μL，氢氯噻嗪峰的信噪比为3.7。以S/N为3和10分别计算氢氯噻嗪的检测限和定量限，分别为0.0814 μg、0.269 μg。

　　2.5  专属性试验

　　称取氢氯噻嗪约20 mg，分别经高温破坏（置坩锅中，电炉上加热至供试品熔融变色）、酸破坏（加0.1 mol/L盐酸溶液5 mL，置水浴中煮沸1 h，放冷，调节pH值至中性）、碱破坏（加0.1 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，置水浴中煮沸1 h，放冷，调节pH值至中性）、氧化破坏（加36%过氧化氢溶液5 mL，室温放置1 h）、光照破坏（1 500 lx光照48 h）后，再分别加甲醇�乙腈（1∶1）5 mL溶解，加流动相稀释至50 mL，摇匀，过滤，精密量取续滤液5 mL置50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。取上述破坏后的样品溶液，照上述色谱条件分析，记录色谱图。色谱图见图3。

　　图3  专属性试验色谱图（略）

　　从上述图谱可以看出，本品经破坏后产生的降解产物均能与氢氯噻嗪主峰有效分离，用二极管阵列检测器在210 nm至400 nm的范围内扫描，氢氯噻嗪主峰的峰纯度均在990以上。说明上述条件可用于测定氢氯噻嗪的含量。

　　2.6  精密度试验

　　取“2.3”项下浓度为0.04 mg/mL的溶液，照上述色谱条件进行分析，连续进样5次，记录色谱图。峰面积的RSD为0.05%。

　　2.7  系统耐用性

　　分别用Agilent公司、pHenomenex公司、Aichrom公司的色谱柱按上述条件试验，不同公司的色谱柱对检测影响不大，结果基本一致。说明本方法的耐用性较好。

　　2.8  重复性试验

　　精密称取氢氯噻嗪原料共6份，各约20 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇�乙腈（1∶1）5 mL溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液5 mL置50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。氢氯噻嗪对照品同法配制作为对照品溶液。按上述色谱条件分析，记录色谱图。计算氢氯噻嗪原料含量平均值为99.32%，RSD为1.23%。

　　2.9  回收率试验

　　精密称取氢氯噻嗪样品和对照品各20.00 mg，浓度均精密定容为0.04 mg/mL，各取10 mL样品溶液，分别精密加入80%、100%、120%（以体积计）的对照品溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，以外标法定量，计算回收率，结果见表1。

　　表1  加样回收率试验结果（略）

　　3  讨论

　　氢氯噻嗪原料药的现行质量标准为《中国药典》2005年版二部，含量测定项采用非水滴定法，专属性不强，氢氯噻嗪的合成中间体及水解产物4�氨基�6�氯�1,3�苯二磺酰胺会消耗滴定液，此外甲醇钠滴定液毒性较大且浓度不稳定，在实际工作中既不环保也不方便操作。采用高效液相色谱法测定，方法简便可行。氢氯噻嗪合成中间体及水解产物4�氨基�6�氯�1,3�苯二磺酰胺和氢氯噻嗪主峰分离度较好，减少了该杂质对含量测定的影响。以流动相配制的溶液，在12 h内稳定。该方法专属性强，灵敏度高，重复性好，操作简便，适用于氢氯噻嗪原料的质量控制。

　　【参考文献】

　　［1］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（二部）［S］. 北京: 化学工业出版社, 2005: 406.

　　［2］ 美国药典委员会. 美国药典［S］. 第27版. 2004: 918.