细菌培养检测技术

细菌大多数属异养菌，必须从周围环境中摄取营养，进行新陈代谢及生长繁殖等生命活动。不同细菌的生长条件不尽相同，针对不同的病原菌，选择最佳培养条件，可提高临床分离培养的阳性率，缩短诊断时间。观察不同细菌在人工培养基上的各种代谢活动，可用作鉴别菌种及解释细菌致病性的依据。
　　一、培养基的分类
1. 培养基是人工配制的适合细菌生长繁殖的混合营养制品。培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。
（1）液体培养基：液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，可供细菌增殖及鉴定使用。由于液体培养基发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。
（2）半固体培养基：是在液体培养基中加入0.2%～0.5%的琼脂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定、保存菌种和测定噬菌体的效价。
（3）固体培养基：是在液体培养基中加入1.5%～2.5%的琼脂。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。
2. 按营养组成和用途的不同，可将培养基分为以下几类：
（1）基础培养基：基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。基础培养基也可以作为一些特殊培养基的基础成分，再根据某种微生物的特殊营养需求，在基础培养基中加入所需营养物质。
（2）营养培养基：即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基，这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。营养培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物，如链球菌、肺炎链球菌等需要含有血液的培养基中才能生长良好。
（3）选择培养基：选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。例如培养肠道致病菌的SS培养基，其中添加的胆盐、枸橼酸钠和煌绿能抑制大部分革兰阳性菌和大肠埃希菌，从而分离到致病的沙门菌核志贺菌。
（4）鉴别培养基：鉴别培养基是用于培养和鉴别不同细菌的培养基。在培养基中加入某种特殊化学物质，利用细菌在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种细菌区分开来。如常用的糖发酵管、三糖铁培养基等
（5）厌氧培养基：专供厌氧菌的分离、培养和鉴别用的培养基。这种培养基营养丰富，且通常在培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基、牛心脑浸液培养基等。
此外，还可根据对培养基成分了解的程度将其分为合成培养基、半合成培养基和天然培养基三类。
　　二、细菌的分离接种
细菌的分离接种是人工分离培养细菌的重要步骤，其目的是从含多种细菌的患者标本中分离出单一病原菌，从而可以进行感染性疾病的病原学诊断。同时，在细菌学的研究，生物制品如疫苗、类毒素、抗毒素和免疫血清等的制备，基因工程及工农业生产等方面，都有着重要的意义。
细菌的接种方法根据目的和培养基的不同可分别采用画线法、穿刺培养法、斜面接种法、液体培养基接种法等。接种时要注意无菌操作，避免污染。
1. 平板画线法　画线接种的方法很多，如平行画线法、分区画线法、棋盘格画线法等。被检标本如脓汁、粪便、尿液、脑脊液等常混杂多种细菌，通过画线法可使混杂的各种细菌在琼脂平板表面分散生长，各自形成不同的菌落，再根据菌落的形态特征，挑选单个菌落继续培养，以此获得细菌的纯种，用于进一步研究、鉴定或保存。方法如下：
（1）接种环于火焰上烧灼灭菌，待冷却后蘸取少许标本，在固体琼脂平板上的一区连续平行画线约占平板面积的1/10，为第一组线。
（2）将接种环烧灼灭菌，待冷却后，转动培养皿60°左右，将接种环通过第一组线再划第二组线，同法进行第三组、第四组画线接种。如图16-1所示。

2. 斜面培养基接种法　斜面培养基常用于纯菌种的繁殖，作为短期保存菌种或观察某些生化特性，如琼脂斜面、枸橼酸盐斜面等。固体斜面接种后沿接种线长成单一、整齐的菌苔，不能分成单个菌落。方法如下：
（1）接种环烧灼灭菌，待冷却后蘸取少许菌苔。
（2）斜面培养基斜面向上，管口经火焰烧灼灭菌，将接种环伸入，自下而上沿斜面中线划一直线，再自底部向上连续蛇形画线。如图16-2所示。

3. 穿刺接种法　穿刺接种法多用于观察细菌在半固体培养基中的生长情况以及某些生化反应。用穿刺法接种的培养基有半固体琼脂培养基、醋酸铅培养基、明胶培养基等。接种方法如下：
（1）接种针在火焰上烧灼灭菌后，待冷却蘸取少许菌苔。
（2）培养基管口经火焰烧灼灭菌后，将接种针垂直刺入培养基中心，深度至近底部0.5cm处，循原路退出。
接种后经孵育，有动力的细菌沿接种线向外扩散，呈毛刷状生长；无动力的细菌则无扩散现象出现。
4. 液体培养基接种法　肉汤培养基、蛋白胨水以及各种单糖发酵管等液体培养基均采用此法进行接种。接种后经培养可观察细菌不同的生长情况，此外还可以进行生化特性的测定。方法如下：
（1）接种环烧灼灭菌，待冷却后蘸取少许菌苔。
（2）液体培养基管口经火焰烧灼灭菌后，将接种环伸入，在接近液体表面的管壁上轻轻研磨，并蘸取少量液体调和，使菌种混合于液体培养基中。
　　三、细菌在培养基中的生长情况
（一）固体培养基上的生长情况
标本或培养物画线接种到固体培养基表面后，单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼可见的细菌集团，称为菌落（colony）。各种菌落在固体培养基上形成的菌落在大小、形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）、黏度以及在血琼脂平板上的溶血情况等均有不同，这有助于识别和鉴定细菌。
1. 菌落的形态特征　据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为3型。
（1）光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，新分离的细菌大多呈光滑型菌落。
（2）粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型，如炭疽芽孢杆菌、结核分枝菌等。
（3）黏液型菌落（M型菌落）：菌落黏稠、有光泽、似水珠样。多见于有厚荚膜或丰富黏液层的细菌。
2. 菌落的溶血特征　菌落溶血有下列3种情况。
（1）α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为血红蛋白氧化成高铁血红蛋白所致；
（2）β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；
（3）γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。
3. 色素　有些细菌产生色素，使菌落甚至周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性和脂溶性两种。
4. 气味　某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、白色假丝酵母菌（酵母味）和放线菌（泥土味）等。
（二）液体培养基中的生长情况
细菌在液体培养基中有3种生长现象：①大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊；②少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽孢杆菌等则呈沉淀生长；③枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。
（三）半固体培养基中的生长情况
半固体培养基主要用于细菌动力试验，有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线两边的培养基仍然澄清透明。

思 考 题

1. 细菌的染色与细菌细胞的构造和构成成分有何关系?
2. 光学显微镜下能观察到哪些特殊结构？
3. 如何获得细菌的纯培养？
4. 各种培养基的用途是什么？