流式细胞仪操作规程
互联网
1552
目的:流式细胞仪开机程序、预设获取模式文件、设定和调整、样品分析、关机程序
一.开机程序
1.查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。
2.打开储液箱,倒掉废液,并在废液桶中加入400漂白水原液。打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSF),合上压力阀。确实盖紧桶盖,查所有管路是否妥善安置。
3.将FACSCiur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。排出过滤器内的气泡。
4.如果需要打印,打开打印机电源。
5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Fe中的气泡。
7.分析样品时,先用FACAF或PBS进行HIGHRUN约2分钟。做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。
二.预设获取模式文件(AquisitinTepteFies)
1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2.选取屏幕左列绘图工具中的Dtpt,绘出一个或多个DtPts(点图)。从DtPt对话框中选取Aquisitin作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数。
3.选取屏幕左列绘图工具中的Histgr,同上法可绘出Histgr(直方图)。
4.将此视窗命名后储存于FACSttinG3BDAppitinsCELLQuestFerEXP文件夹中,下次进行相同实时可直接调用。本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACSttinG3BDAppitinsCELLQuestEXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA测,EXP用于细胞表面标志分析。
三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整
1.从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在Fie指令栏中打开合适的获取模式文件。
2.从屏幕上方Aquire指令栏中,选取CnnettCyteter(快捷键:+B)进行电脑和仪器的连机。将出现的AquisitnCntr对话框移至合适位置。
3.从Cyteter指令栏中,开启Detetrs/Aps、Thresh、Cpenstin、Sttus等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框。
4.在Detetrs/Aps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式(pifiere):线性模式Lin或对数模式Lg。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDMPr选择FL2,而FL1,FL2与FL3则以对数模式Lg测量;分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDMPr选择FL2;分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Lg进行测量。
5.放上待测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH或LOW上。
6.在AquisitnCntr对话框中,选取Aquire,开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Puse,Restrt以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“”。
7.在Detetrs/Aps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度:PMTvtges(粗调)与ApGins(细调),使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。
8.在Thresh对话框中选择适当的参数设定Thresh,并调整Thresh的高低,以减少噪音信号(细胞碎片)。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H。Thresh并不影响测器对信号的获取,但可改善画面质量。
9.从屏幕左列绘图工具中选取Regin(区域),并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。
10.Detetrs/Aps对话框中,调整荧光测器(FL1,FL2,FL3,FL4等)的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内。
11.在Cpenstin对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色(或多色)荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+FL2-的细胞群却分布在FL1+FL2+区域内,则需调大FL2-?%FL1中的“?”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
12.在Sttus对话框中可见:LserPer:正常值-Run/Rey为147W,Stny为5W;Lserurrent:正常值为6Aps左右。
13.调整好的仪器设定可在InstruentSettings对话框中储存,下次进行相同实时可调出使用,届时只需微调即可。本计算机中已有三个名叫储存于FACSttinG3BDAppitinsCELLQuestFerIMM-InstrSettings及FACSttinG3BDFiesInstruentSettingsFiesCiFie和Mst-Ce-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞。
一.开机程序
1.查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。
2.打开储液箱,倒掉废液,并在废液桶中加入400漂白水原液。打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSF),合上压力阀。确实盖紧桶盖,查所有管路是否妥善安置。
3.将FACSCiur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。排出过滤器内的气泡。
4.如果需要打印,打开打印机电源。
5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Fe中的气泡。
7.分析样品时,先用FACAF或PBS进行HIGHRUN约2分钟。做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。
二.预设获取模式文件(AquisitinTepteFies)
1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2.选取屏幕左列绘图工具中的Dtpt,绘出一个或多个DtPts(点图)。从DtPt对话框中选取Aquisitin作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数。
3.选取屏幕左列绘图工具中的Histgr,同上法可绘出Histgr(直方图)。
4.将此视窗命名后储存于FACSttinG3BDAppitinsCELLQuestFerEXP文件夹中,下次进行相同实时可直接调用。本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACSttinG3BDAppitinsCELLQuestEXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA测,EXP用于细胞表面标志分析。
三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整
1.从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在Fie指令栏中打开合适的获取模式文件。
2.从屏幕上方Aquire指令栏中,选取CnnettCyteter(快捷键:+B)进行电脑和仪器的连机。将出现的AquisitnCntr对话框移至合适位置。
3.从Cyteter指令栏中,开启Detetrs/Aps、Thresh、Cpenstin、Sttus等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框。
4.在Detetrs/Aps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式(pifiere):线性模式Lin或对数模式Lg。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDMPr选择FL2,而FL1,FL2与FL3则以对数模式Lg测量;分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDMPr选择FL2;分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Lg进行测量。
5.放上待测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH或LOW上。
6.在AquisitnCntr对话框中,选取Aquire,开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Puse,Restrt以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“”。
7.在Detetrs/Aps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度:PMTvtges(粗调)与ApGins(细调),使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。
8.在Thresh对话框中选择适当的参数设定Thresh,并调整Thresh的高低,以减少噪音信号(细胞碎片)。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H。Thresh并不影响测器对信号的获取,但可改善画面质量。
9.从屏幕左列绘图工具中选取Regin(区域),并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。
10.Detetrs/Aps对话框中,调整荧光测器(FL1,FL2,FL3,FL4等)的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内。
11.在Cpenstin对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色(或多色)荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+FL2-的细胞群却分布在FL1+FL2+区域内,则需调大FL2-?%FL1中的“?”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
12.在Sttus对话框中可见:LserPer:正常值-Run/Rey为147W,Stny为5W;Lserurrent:正常值为6Aps左右。
13.调整好的仪器设定可在InstruentSettings对话框中储存,下次进行相同实时可调出使用,届时只需微调即可。本计算机中已有三个名叫储存于FACSttinG3BDAppitinsCELLQuestFerIMM-InstrSettings及FACSttinG3BDFiesInstruentSettingsFiesCiFie和Mst-Ce-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞。