不常见革兰阴性菌的快速鉴定方法
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病原学检测对于感染性疾病的诊断和治疗非常重要，因此，临床微生物实验室在医院感染治疗和控制中起到关键作用。目前，大部分临床微生物实验室采用商品化的鉴定系统鉴定临床分离的细菌，但是对于一些临床不常见的细菌，传统的鉴定方法(如革兰染色、生化反应等)更加实用有效。因此，本文参照CLSI M32-A2文件列举了一些临床不常见细菌的特征和鉴定方法，希望对临床微生物实验室的常规工作有所帮助。
一. 不常见革兰阴性菌
1. 布氏杆菌属
布氏杆菌属是一类革兰阴性细小杆菌，牛、羊、猪等动物最易感染。人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品，均可被感染。布氏杆菌病广泛分布世界各地，我国部分地区曾有流行。布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6个种，20个生物型。中国流行的主要是羊、牛、猪三种布氏杆菌，其中以羊布氏杆菌病最为多见。
布氏杆菌属细菌为非抗酸性，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，呈球杆状(见图1)。血琼脂(BAP)上为透明或半透明、光滑且有光泽菌落。此细菌不在麦康凯琼脂上生长。布氏杆菌属细菌尿素阳性，触酶、氧化酶阳性，而吲哚阴性。由于该菌属细菌具有强的传染性，因此一旦怀疑应送往LRN B级参考实验室进行确认。
2. 空肠弯曲菌
空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食物源性病原菌，认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。其致病因素包括粘附、侵袭、产生毒素和分子模拟机制等四个方面，通过分子模拟机制可以引起最严重的并发症一格林一巴利综合征。空肠弯曲菌可以通过产生细胞紧张性肠毒素、细胞毒素和细胞致死性膨胀毒素而致病。空肠弯曲菌对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感，但近年发现了不少耐药菌株及多重耐药性菌株。
空肠弯曲菌菌体轻度弯曲似逗点状。菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。微需氧菌，在含2.5～5% 氧和10% CO2的环境中生长最好，在正常大气或无氧环境中均不能生长，最适温度为37～42℃。本菌在普通培养基上难以生长，在凝固血清和血琼脂培养基上培养36 小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象。空肠弯曲生化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素。可还原硝酸盐，氧化酶和触酶为阳性。能产生微量或不产生硫化氢，甲基红和v-p试验阴性，枸椽酸盐培养基中不生长,在弯曲菌中马尿酸呈阳性反应具有重要鉴定价值。
3.“HACEK”群细菌
HACEK是指一组革兰阴性杆菌：嗜血杆菌属(H)、放线杆菌属(A)、人心杆菌属(C)、艾肯菌属(E)、金氏杆菌属(K)。这组微生物的共同特征是易导致心内膜感染，约占全部感染性心内膜炎的5-10%，它们是导致正常人群(非静脉药物滥用者)心内膜炎的常见原因之一。所有这些微生物都是口咽部正常菌群的一部分，生长缓慢、喜好富二氧化碳环境。除心脏瓣膜感染，HACEK菌还导致其他感染：菌血症、各类脓肿、腹膜炎、中耳炎、结膜炎、肺炎、化脓性关节炎、骨髓炎、尿路感染、伤口感染、脑脓肿、牙周感染。
嗜血杆菌属因在生长过程中需含有生长因子X(氯化高铁血红素)和(或)V(辅酶Ⅰ)的血液琼脂而得名。本属细菌为革兰阴性小杆菌，无动力，具有明显的多型性，不形成芽胞，需氧或兼性厌氧。流感嗜血杆菌是嗜血杆菌属最重要的病原菌，镜下呈球杆状、长杆状、少数为丝状。粘液型菌株有荚膜，毒力较强。菌落一般为光滑型，若与金黄色葡萄球菌在BAP上共同孵育，则在葡萄球菌菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落较大，这叫做“卫星现象”。原因是金黄色葡萄球菌能合成较多的V因子，促进流感嗜血杆菌的生长。
放线杆菌属为革兰阴性杆菌，有时呈球形、椭圆形(见图3)。兼性厌氧菌，无动力，无荚膜，在含血清或血液的培养基上生长良好，37℃培养2～3天后形成直径约1mm的菌落。在肉汤培养液中生长呈颗粒状。对人或动物致病的有伴放线放线杆菌、林氏放线杆菌和马驹放线杆菌。伴放线放线杆菌因常见于人类的某些放线菌病的病灶中而得名。但也可单独致病，如一些亚急性细菌性心内膜炎是由本菌引起的。本属细菌能还原硝酸盐，不产生吲哚，尿素阳性。
人心杆菌是心杆菌属内唯一的种，是人的鼻腔和咽喉部的正常菌群，可引起心内膜炎、尿路感染、脑脓肿和牙周炎等疾病。大部分菌株可从血液中分离而来，有的菌株也可从脑脊液中分离而来。人心杆菌为无鞭毛、无荚膜、无芽孢，并具有多形性的革兰阴性杆菌(见图4)。革兰染色不易被脱色，单个存在或成对排列，有时形成短链或呈葡萄状排列。该菌为兼性厌氧菌，某些菌株在初代分离时需要CO2，在生长过程中要有一定湿度，在干燥环境中不生长；在35～37 ℃均可生长，但在22 ℃或42 ℃均不生长。该菌在BAP上不溶血，经24h 培养后菌落很小，48h 后可达1mm，菌落为圆形、凸起、光滑、有光泽而边缘整齐，某些菌株的菌落可长入培养基中，使培养基表面琼脂凹陷。麦康凯琼脂上不生长。人心杆菌氧化酶阳性，触酶阴性，吲哚阳性，不还原硝酸盐。
啮蚀艾肯菌是革兰阴性多形性球杆菌(见图5)，有一种漂白剂的气味，兼性厌氧，是口腔和许多其他粘膜表面的正常菌群。啮蚀艾肯菌是人咬伤后发生的蜂窝织炎的病原体，它也是已发现静脉药物滥用者软组织感染和心内膜炎主要病原体。它也能导致各种各样的肺部感染(如脓胸、肺炎、败血症栓子)，类似严格偏性厌气菌。
大多数啮蚀艾肯菌性心内膜炎患者有潜在的生物瓣膜病变。与其他HACEK菌不同，大多数啮蚀艾肯菌性心内膜炎与静脉药物滥用有关。啮蚀艾肯菌在培养基上凹陷生长，吲哚阴性，鸟氨酸阳性。
金氏杆菌属是革兰阴性球杆菌(见图6)，有3个种：
金氏金氏杆菌、产吲哚金氏杆菌、去硝化金氏杆菌，只有金氏金氏杆菌引起心内膜炎。与其他HACEK菌不同，金氏杆菌感染进展相当迅速。金氏金氏杆菌在 BAP呈大的、光滑、不透明、白色或米色、β-溶血菌落，与肠杆菌科细菌相似，但在麦康凯琼脂上不生长。金氏金氏杆菌触酶阴性，氧化酶阳性，通常分离自无菌组织和体液。
4. 土拉热弗朗西斯氏菌
土拉热弗朗西斯氏菌简称土拉弗氏菌，是引起土拉弗氏菌病(野兔热)的病原菌。人类感染此病多因接触患病动物而致，或摄食污染食物和吸入污染空气所致。土拉杆菌是革兰阴性多形性细菌，镜下呈球状、杆状、豆状和丝状等，无芽胞、无动力、有荚膜。该菌营养要求较高，在普通琼脂培养基和肉汤中均不生长，只在加入
胱氨酸、半胱氨酸、血液或卵黄的培养基中生长，形成圆形、光滑、灰色、凸起、有粘性的菌落，在鸡胚绒尿膜上也能生长，在卵黄囊中生长尤为茂盛，最适生长温度35℃ ～37℃ 。若从动物或人体初次分离，一般需要3—5天。常用培养基主要有半胱氨酸葡萄糖血液琼脂平板(Francis培养基)、卵黄琼脂平板和半胱氨酸巧克力琼脂。土拉热弗朗西斯氏菌氧化酶阴性，触酶阴性或弱阳性，β-内酰胺酶阳性。由于该菌具有强传染性，必须在生物安全柜中处理，一旦怀疑需送往LRN参考实验室进行确认。
