常规血液分析标准化的进展及质量管理

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上海市临床检验中心 胡晓波

 

 

数十年来，国际血液学标准化委员会（ICSH）先后推荐了血红蛋白测定（J Clin Pathol,1996年），血细胞压积（J Clin Pathol,1980年）和红细胞、白细胞计数（Clin Lab Haematol,1994年）的参考方法。由于种种原因，血小板计数的参考方法直到2001年才正式公布，成为传统CBC计数 校准、确定血液分析仪校准品靶值的可靠依据（Am J Clin Pathol,2001年）。现将ICSH有关血小板计数的参考方法介绍如下。
一、血小板计数参考方法
ICSH曾经推荐过数种血小板计数的侯选方法，如（1）以草酸铵稀释-相差显 微镜法计数血小板；（2）电阻抗法测定RBC/PLT比率。但是，这些方法很难成为准确的、精确的、可靠的血小板计数参考方法， 原因有二：（1）血小板很难与细胞碎片、背景噪音鉴别；（2）大量红细胞会干扰血小板计数。
随着流式细胞仪普及应用，使血小板直接计数成为可能。一系列血小板标志物（包 括静息或激活），如抗CD42，CD41，CD61等单抗，可以标记循环血液中所有血小板，包括独立血小板，黏附于红细胞的血小 板，黏附于白细胞的血小板等，通过恰当稀释，运用流式细胞术能很好将血小板群体分离出来，为准确计数血小板成为可能。
ICSH推荐的间接血小板计数，即采用流式细胞仪计数PLT与RBC相对数量 ，同时采用半自动、单通道、电阻抗颗粒计数仪准确计数红细胞，通过准确和精确的方法，可以确定血液中血小板数量。
（一）、方法学原理
无菌缓冲液预稀释的EDTA抗凝全血，用特异性荧光标记单克隆抗体染色血小板 。溶液中被染色的血小板稀释成计数浓度，在流式细胞仪上根据荧光强度和散射光计数PLT和RBC。通过RBC/PLT比率测定值 ，和准确的RBC计数值就可得出准确的血小板计数值。
（二）、血液标本
EDTA抗凝的新鲜静脉血液标本（3.7-5.4μmol/ml血液），即K 2EDTA（分子量368.4）浓度为1.4-2.0mg/ml血，K3EDTA（分子量442.5）浓度为1.6-2.4mg /ml血。若需同时测定HCT和MCV值，推荐采用K2EDTA抗凝血。标本放置于室温（18-22℃），4小时内处理完毕。
（三）、玻璃器皿
贮存或稀释标本用的容器避免发生血小板黏附，不能采用平底玻璃器皿。推荐采用 聚丙烯或聚苯乙烯材料制成的容器。
（四）、仪器性能
对于红细胞计数和血小板计数，采用能测量前向散射光和荧光的流式细胞仪。仪器 必须有足够的敏感度来分析FITC标记的、直径2μm球形颗粒的散射光和荧光。
对于全血红细胞计数，采用半自动、单通道、电阻抗颗粒计数仪。仪器测量孔必须 直径80-100μm，长度是直径的70%-100%。容积误差1%以内，并可溯源到国家或国际标准。
（五）、试剂
1、稀释液：0.01mol/lPBS，pH7.2-7.4，含1%小牛血清 （BSA）。
2、染色液：FITC直接标记的能识别血小板GPIIb/IIIa复合物2种 表位的单抗：CD41和CD61。商品FITC标记抗血小板抗体有：抗CD61（clone RUU-PL7F12，Becton Dickinson公司）和抗CD41（clone P2，Beckman Coulter公司）。推荐采用双标记染色法.