（交流）ELISPOT的一点介绍
丁香园
1683
1 起源与发展：
1983年, Czerki8Dnsky；Sedgwick and Holt:
计数 B cells
1988年，Czerkinsky: T cell IFN-r
1988年，Czerkinsky：双色标记（Dual-Color）
1993年，第一台ELISPOT自动分析仪：德国Leica
96-97年，出现了新的ELISPOT分析仪
2 ELISPOT 和 ELISA的区别：
ELISA 回答 “how much”,而ELISPOT回答“What freqency”
ELISA是ImmunoAssay，而ELISPOT是“Bio-Assay”
ELISA非特异，ELISPOT特异性T细胞群
3 其优点：
检测可分泌性细胞因子（蛋白），少至100－1,000个分子/Cell即能够被检测。比ELISA的灵敏度高200倍。Tanguay, S. and Killion, J. J. (1994) Direct comparison of ELISPOTand ELISA. Based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13. 259-263
单细胞水平，少至一个阳性效应细胞即能够被检测出。比FACS灵敏100－1000倍。
大样本量检测：每个研究人员每天可作数百样本的检测。
4 一般操作流程：
包被抗体 4℃ 过夜 （室温或者 37 ℃数小时）
封闭37 ℃一小时
加入淋巴细胞和刺激原37 ℃孵育20~40小时
加入检测抗体37 ℃一小时
加入酶联二抗37 ℃一小时
显色10~60分钟
5技术要点：
外周血提取淋巴细胞时, 应避免凝血引起的细胞活性降低
只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞、其他细胞（特别是粒细胞）、和杂质的干扰
加入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液
预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液变黄）会影响斑点的形成
预孵育后的细胞入ELISPOT培养板前应更换培养液
在ELISPOT板上同时进行抗原刺激、细胞孵育、和抗体结合可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少。此时可以采用两步法，分别进行抗原刺激、ELISPOT板抗体捕获
部分多价抗原刺激物导致细胞凋亡，可以换用单价抗原刺激物
核酸、甾体类、等抗原刺激物的免疫原性较弱，应该加强刺激浓度、辅助刺激物、延长刺激时间等
一般要点：无菌操作，避免污染；细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开关CO2孵箱；显色至可见斑点、时间可适当延长、背景的褪色
1983年, Czerki8Dnsky；Sedgwick and Holt:
计数 B cells
1988年，Czerkinsky: T cell IFN-r
1988年，Czerkinsky：双色标记（Dual-Color）
1993年，第一台ELISPOT自动分析仪：德国Leica
96-97年，出现了新的ELISPOT分析仪
2 ELISPOT 和 ELISA的区别：
ELISA 回答 “how much”,而ELISPOT回答“What freqency”
ELISA是ImmunoAssay，而ELISPOT是“Bio-Assay”
ELISA非特异，ELISPOT特异性T细胞群
3 其优点：
检测可分泌性细胞因子（蛋白），少至100－1,000个分子/Cell即能够被检测。比ELISA的灵敏度高200倍。Tanguay, S. and Killion, J. J. (1994) Direct comparison of ELISPOTand ELISA. Based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13. 259-263
单细胞水平，少至一个阳性效应细胞即能够被检测出。比FACS灵敏100－1000倍。
大样本量检测：每个研究人员每天可作数百样本的检测。
4 一般操作流程：
包被抗体 4℃ 过夜 （室温或者 37 ℃数小时）
封闭37 ℃一小时
加入淋巴细胞和刺激原37 ℃孵育20~40小时
加入检测抗体37 ℃一小时
加入酶联二抗37 ℃一小时
显色10~60分钟
5技术要点：
外周血提取淋巴细胞时, 应避免凝血引起的细胞活性降低
只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞、其他细胞（特别是粒细胞）、和杂质的干扰
加入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液
预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液变黄）会影响斑点的形成
预孵育后的细胞入ELISPOT培养板前应更换培养液
在ELISPOT板上同时进行抗原刺激、细胞孵育、和抗体结合可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少。此时可以采用两步法，分别进行抗原刺激、ELISPOT板抗体捕获
部分多价抗原刺激物导致细胞凋亡，可以换用单价抗原刺激物
核酸、甾体类、等抗原刺激物的免疫原性较弱，应该加强刺激浓度、辅助刺激物、延长刺激时间等
一般要点：无菌操作，避免污染；细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开关CO2孵箱；显色至可见斑点、时间可适当延长、背景的褪色
