【交流】关于RNAi中off-target的一点思考

几乎所有的siRNA都不可避免的产生off-target效应，好一点的也许只会off-target几个基因，差一点的甚至可以off-target几十个基因。关于off-target的机制，以前认为是siRNA的sense strand对于其他基因mRNA的干扰造成，对于这个效应，可以利用最新的化学修饰方法削弱sense strand与RISC的结合，同时增强anti-sense与RISC的结合力，按照这个原理虽然也可以减少基因的非特异性抑制，但是效果并不显著。目前的研究认为off-target的效应与miRNA对基因的调节机制相似。一个miRNA对于蛋白翻译的抑制并不会仅仅限于一个基因，往往会调节一系列基因的表达。这种调节机制部分程度上是通过miRNA 5'的seed region sequence来介导，seed region sequence可以通过与很多基因的3'-UTR端进行互补结合，抑制蛋白的翻译。而miRNA的off-target效应也和这个过程有关系，大部分miRNA的anti-sense strand的5'端均含有类似miRNA的seed region的序列，长度和位置大概位于5'端1-6/2-7/3-8大概6个核苷酸，这个序列可以与很多基因的3'-UTR的互补序列结合，因此可以产生广返的基因表达抑制，表现出off-target效应。

RNAi的实验若off-target的作用很广泛的话，那么就很难说明实验中出现的结果到底是由于研究的靶基因被干扰掉所影响，还是其他的基因表达发生变化所产生的后果。即使使用阴性对照，若这个对照不合适，也很难让实验结果使人信服。

目前很多阴性对照使用scramble sequence，包括很多网上的设计软件也提供这种对照的获得方法，即把靶序列完全打乱，使对照序列整个的碱基构成不变，但是序列改变。虽然靶序列和scramble sequence都经过blast，证实与别的基因没有同源性，但是不能排除序列中10个碱基以下，尤其是5'的连续碱基序列可以和别的基因3'-UTR发生互补，从而导致off-target效应。因此，即使RNAi组与sramble sequence相比显示目标基因的确被沉默，但是对于细胞表型的变化（包括所要观察的功能），很难说是否就是目标基因的表达改变所引起，因为RNAi组和scramble组都避免不了off-target效应，即两组都会对其他基因的表达产生干扰，而且因为5'序列的差异，它们各自的off-target效应是有差异的，那么细胞表型的改变就无法归因于目标基因的沉默（尽管目标基因的确被沉默了）。对于结果的分析很可能会出现假阳性。但是出现假阴性的可能性不大。

如果使用目前最为公认的通用阴性对照，通用阴性对照是已经经过验证的对细胞内所有基因表达都没有影响的，使用这类对照，虽然对照组没有任何影响基因表达变化的可能，包括对靶基因也不会产生沉默效应，但是对于RNAi处理组，虽然靶基因已经证实被沉默，但因为仍然可能存在着off-target效应，所以，不排除细胞表型的变化可能会由于其他off-tageted gene expression所造成。对于结果的分析也会出现假阳性。

那么若要排除off-target效应对于实验结果的影响，可能的办法是
若使用通用阴性对照，对于设计的RNAi序列，应该尽量排除5'端出现seed sequence，或者是否可以采用化学修饰的方法抑制该序列与mRNA 3'-UTR的结合。
若使用scramble sequence作为对照，那么对照序列的设计，可以保留前10位碱基的顺序，把后面的碱基顺序打乱，这样即使出现off-target效应，那么与RNAi的off-target效应基本达到一致。

上面是我对off-targe的一点理解，不对的地方还请各位同仁指正