【分享】给大家介绍一下引物质量的问题吧
丁香园论坛
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我以前在一家引物合成公司做技术支持，主要解答客户各种因为引物质量问题引发的实验问题），现在自己合成引物自己做实验用，对引物质量问题有了更进一步的认识，写出来跟大家共享一下吧，也让大家能判断什么时候是自己的问题，什么时候是运气不好碰上了小概率事件，什么时候是合成公司的问题。我也顺便整理一下思路，最近一个月一直看那些引物合成的文献，头都大了。
现在引物质量问题主要体现在三个方面：
1、pcr产物测序发现引物部分碱基错误
2、PCR扩增没有结果或结果不好
3、实验结果不稳定，主要因为引物保存期太短，容易降解。
第一点：关于测序发现碱基错误，包括内部缺失、增加、错配，其中最常见的是缺失。相信这一点很多公司都给过解释，大致的意思就是：化学合成的效率不可能达到100％，其中两个核苷酸之间耦联的效率不可能达到100%，耦联失败的序列会用cap试剂来封闭，避免进入下一个反应循环，但这个效率也不会是100%，总有逃过的，所有就出现了内部少一个碱基的引物混在你要的最终产物里面，pcr后挑克隆，就存在挑到这种克隆的概率。错配、增加碱基的原理我就不一一解释了。
当然，合成之后还有纯化，最常见的就是OPC纯化（生工的HAP）、和PAGE纯化，OPC纯化是一种柱纯化，类似亲和层析，利用引物5‘端的DMT，这种纯化的优点就是速度非常快，十几分钟应该就可以了，没有顺利合成到5’端（也就是那些被cap掉的失败引物）都会被纯化掉。缺点就是内部碱基错误的，他无能为力，包括内部碱基缺失，哪怕缺四五个碱基，他也没办法。page纯化是利用分子量的大小来纯化，理论上来说能达到非常高的纯度。我以前被培训的概念是page纯化也无法排除内部缺少一个碱基的序列，因为分辨率达不到，不过后来请教了另外一家公司的一位引物合成的专家，他告诉我page纯化完全可以做到，只要电泳时间足够长，分的足够开。这一点目前我还没有验证。等验证了再告诉大家。不过我可以肯定的一点就是，page纯化，人为操作的因素影响很大，做过琼脂糖凝胶回收的朋友相信都能理解这一点。电泳分离时间的长短、切胶时候的手法等，都会明显影响引物的纯度。如果我为了赶出货速度，象征性的电泳半小时一小时的就开始切，为了产量高一点切胶宽一些，纯度就更没有保障了，所以现在很多公司的page纯化的质量依然很差。
那么经过纯化的引物应该达到什么样的纯度呢？这好像没有一个统一的规定。但如果你测序10个发现5个有错误，公司还给你解释化学合成效率问题、基因突变问题、taq酶错配问题，那就纯属瞎扯了。
什么情况会造成测序10个发现5个错误呢？相信目前没有一家公司是每次都这么高的错误率的，不然早就被市场淘汰了。目前大家引物的错误率都比较高是真的，价格降到这个份上了，只能努力压缩成本，各种原材料尽量国产化，而其中很多合成试剂对合成质量至关重要，直接关系到内部缺失碱基引物的比例。但大家也没办法。我现在自己合成引物，为了满足实验要求，可以说是不计成本，基本都用进口试剂，有的甚至是ABI原装的，氩气人家告诉我用99.95%的，我为了保险，买99.999%的，如果让我按照一块多的价格卖引物，即使不算工资、水电、厂房等费用，也会赔钱，可以想象引物合成公司现在的压力。 一分钱一分货，所以现在引物质量普遍不是很高。而当试剂保存时间比较长、在机器上时间比较长、空气湿度大等因素引起ATCG几个单体的水解等，或者哪一批试剂质量不够，再加上纯化、质检不严格，就可能出现引物纯度降到非常低，甚至只有20-30%。
好久没打这么多字了，有空继续跟大家聊，这次就先说这么多，下次继续解释其余两点。
加分鼓励，期待更多精彩内容！
___sword20000
现在引物质量问题主要体现在三个方面：
1、pcr产物测序发现引物部分碱基错误
2、PCR扩增没有结果或结果不好
3、实验结果不稳定，主要因为引物保存期太短，容易降解。
第一点：关于测序发现碱基错误，包括内部缺失、增加、错配，其中最常见的是缺失。相信这一点很多公司都给过解释，大致的意思就是：化学合成的效率不可能达到100％，其中两个核苷酸之间耦联的效率不可能达到100%，耦联失败的序列会用cap试剂来封闭，避免进入下一个反应循环，但这个效率也不会是100%，总有逃过的，所有就出现了内部少一个碱基的引物混在你要的最终产物里面，pcr后挑克隆，就存在挑到这种克隆的概率。错配、增加碱基的原理我就不一一解释了。
当然，合成之后还有纯化，最常见的就是OPC纯化（生工的HAP）、和PAGE纯化，OPC纯化是一种柱纯化，类似亲和层析，利用引物5‘端的DMT，这种纯化的优点就是速度非常快，十几分钟应该就可以了，没有顺利合成到5’端（也就是那些被cap掉的失败引物）都会被纯化掉。缺点就是内部碱基错误的，他无能为力，包括内部碱基缺失，哪怕缺四五个碱基，他也没办法。page纯化是利用分子量的大小来纯化，理论上来说能达到非常高的纯度。我以前被培训的概念是page纯化也无法排除内部缺少一个碱基的序列，因为分辨率达不到，不过后来请教了另外一家公司的一位引物合成的专家，他告诉我page纯化完全可以做到，只要电泳时间足够长，分的足够开。这一点目前我还没有验证。等验证了再告诉大家。不过我可以肯定的一点就是，page纯化，人为操作的因素影响很大，做过琼脂糖凝胶回收的朋友相信都能理解这一点。电泳分离时间的长短、切胶时候的手法等，都会明显影响引物的纯度。如果我为了赶出货速度，象征性的电泳半小时一小时的就开始切，为了产量高一点切胶宽一些，纯度就更没有保障了，所以现在很多公司的page纯化的质量依然很差。
那么经过纯化的引物应该达到什么样的纯度呢？这好像没有一个统一的规定。但如果你测序10个发现5个有错误，公司还给你解释化学合成效率问题、基因突变问题、taq酶错配问题，那就纯属瞎扯了。
什么情况会造成测序10个发现5个错误呢？相信目前没有一家公司是每次都这么高的错误率的，不然早就被市场淘汰了。目前大家引物的错误率都比较高是真的，价格降到这个份上了，只能努力压缩成本，各种原材料尽量国产化，而其中很多合成试剂对合成质量至关重要，直接关系到内部缺失碱基引物的比例。但大家也没办法。我现在自己合成引物，为了满足实验要求，可以说是不计成本，基本都用进口试剂，有的甚至是ABI原装的，氩气人家告诉我用99.95%的，我为了保险，买99.999%的，如果让我按照一块多的价格卖引物，即使不算工资、水电、厂房等费用，也会赔钱，可以想象引物合成公司现在的压力。 一分钱一分货，所以现在引物质量普遍不是很高。而当试剂保存时间比较长、在机器上时间比较长、空气湿度大等因素引起ATCG几个单体的水解等，或者哪一批试剂质量不够，再加上纯化、质检不严格，就可能出现引物纯度降到非常低，甚至只有20-30%。
好久没打这么多字了，有空继续跟大家聊，这次就先说这么多，下次继续解释其余两点。
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___sword20000
