丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

【分享】MIRNA(microRNA)检测实验流程(加polyA法) (2011

丁香园论坛

1900
microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA,其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式,都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此,对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法,这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。miRNA qPCR Detection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR技术来对miRNA进行检测,其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。

以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit来对miRNA进行检测的实验操作流程:

二:背景资料
检测人脑组织中miRNA的表达。所选的miRNA及其扩增长度信息如下:

   Primer ID  Mature_Acc  Mature_ID  PCR_SIZE
1  hsmq-0031_01   MIMAT0000069   has-miR-16   75
2  hsmq-0032_01   MIMAT0000422   hsa-miR-124   73
3  hsmq-0033_01   MIMAT0000443   hsa-miR-125a-5p   77
4  hsmq-0034_01   MIMAT0000423   hsa-miR-125b   75
5  hsmq-0035_01   MIMAT0000429   hsa-miR-137   76
6  hsmq-0036_01   MIMAT0000250   hsa-miR-139-5p   75
7  hsmq-0037_01   MIMAT0000437   hsa-miR-145   76
8  hsmq-0038_01   MIMAT0000450   hsa-miR-149   76
9  hsmq-0039_01   MIMAT0000439   hsa-miR-153   75
10  hsmq-0040_01   MIMAT0000452   hsa-miR-154   75
11  hsmq-0041_01   MIMAT0000259   hsa-miR-182   77
12  hsmq-0042_01   MIMAT0000261   hsa-miR-183   75
13  hsmq-0043_01   MIMAT0000458   hsa-miR-190   75
14  hsmq-0044_01   MIMAT0000276   hsa-miR-219-5p   74
15  hsmq-0045_01   MIMAT0000077   hsa-miR-22   75
16  hsmq-0046_01   MIMAT0000082   hsa-miR-26a   75
17  hsmq-0047_01   MIMAT0000100   hsa-miR-29b   76
18  hsmq-0048_01   MIMAT0000244   hsa-miR-30c   76
19  hsmq-0049_01   MIMAT0000441   hsa-miR-9   76
20  hsmq-0050_01   MIMAT0000689   hsa-miR-99b   75
21  hsnRNA-U6_01   M14486   hsnRNA-U6   81

三:实验内容
RNA抽提、RNA 加“PolyA”处理、RNA反转录、定量PCR检测及其数据分析。

四:实验主要仪器和试剂
主要实验仪器:冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统 iQ5 Real Time PCR Detection System。

主要实验试剂:TRIzol(Invitrogen)、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、miRNA qPCR Detection Kit。

五:实验操作
前期准备:为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性,在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头,同时实验操作时,需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行Total RNA抽提。

1、样品处理:取50mg~200mg样品直接在液氮中研磨至粉末,再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中,反复振荡裂解组织细胞。(Note:如为贴壁细胞,去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol),反复吹打裂解细胞,再收集TRIzol至离心管中;如为悬浮细胞,离心收集悬浮细胞,加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞)。

2、相分离:室温放置上述样品液10min左右后,每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL,盖上盖子,剧烈振荡约1min,室温静置5min,然后12000g 冷冻离心15min(4℃),小心取出样品,通过观察可以发现样品分三层,其中最上层含有RNA样品。

3、RNA沉淀:小心吸取上清液约450μL(每1mLTRIzol 的吸取量)至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中,混匀,12000g 冷冻离心10min(4℃)。

4、RNA洗涤:去上清,加入500μL 冷冻的75%乙醇,弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min(4℃),去上清,再稍离,吸去上清液。

5、RNA溶解:风干约5~10min(注意不能风太干,只需要沉淀泛白即可),加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。

6、RNA浓度测定:吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后,在分光光度计Nanodrop上测定RNA浓度,以DEPC水做空白对照,同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。Note:如为常规的分光光度计,注意比色杯测定时的最少所需体积量,取一定量的RNA,用DEPC水稀释约100倍左右,同时在紫外条件下测定OD260和OD280,再按照公式计算RNA浓度=40ng/μL×OD260×稀释倍数)。

7、RNA电泳检测:
7.1 变性胶制备:取1.2g Agarose + 75mL去离子水煮沸,冷却至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上,盖上盖子。
7.2 电泳缓冲液配制(1×Mops):取50mL10×Mops ,用去离子水稀释至500mL,倒入电泳槽中。
7.3 RNA样品处理:取RNA样品约3μL,最后补充DEPC水至15μL,65℃变性10min后立即冷却,加入2μL 10×RNA loading buffer 即可电泳。
7.4 RNA电泳:先把RNA胶放入电泳槽中,100V作用电泳约5min,再在点样孔中点入处理过的RNA样品,100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处,取胶拍照。

8、RNA抽提结果:
8.1. RNA电泳图(取3ul RNA 样品):


8.2 RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和OD 260/OD280。

RNA来源  RNA浓度(ng/ul )  OD 260/OD280
人脑组织   3470  1.9

9、miRNA 3’端进行加“Poly A”处理
融解加“PolyA”反应所需的试剂,上下轻微颠倒混匀,短暂离心后放置冰上待用。
PolyA Reaction 反应液的配制
在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积20μL

试剂组分   体积   终浓度
Total RNA      2μg
2.5U/μLPolyA Polymerase   1μL   2.5U
10×PolyA Polymerase Buffer   2μL   1×
10×rATP Solution   2μL   1×
ddH2O(RNase/DNase free)   补至20μL   
在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。
Total RNA使用量可在100ng~10μg之间调整,如使用纯化的小分子RNA,其使用量可在10ng~1μg之间调整。

10、PolyA反应:
混匀配制的反应mix,短暂离心后在37℃反应15min。所得的反应液可以直接进行下游实验,也可以放置-20℃短暂保存,如需长期保存建议存放于-80℃。

11、Poly A化的RNA进行反转录反应:
融解反转录反应所需的试剂,上下轻微颠倒混匀,短暂离心后放置冰上待用。RNA-Primer Mix 的配制反应:
在冰上预冷的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μL
试剂组分   体积   终浓度
PolyA反应液   2μL    
25×Oligo dT Adaptor   1μL   1×
ddH2O(RNase/DNasfree)   10μL    
Final Volume   13μL    
混匀RNA-Primer Mix,短暂离心,直接65℃变性10min后立即放置冰上至少2min。

配制反转录反应液:
在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL。
试剂组分   体积   终浓度
RNA-Primer Mix   13μL   
5×RT Reaction Buffer   5μL   1×
25mM dNTP   1μL   1mM
25U/μL RNase Inhibitor   1μL   25U
200U/μL M-MLV RTase (RNase H free)   1μL   200U
ddH2O(RNase/DNase free)   4μL   
Final Volume   25μL   

反转录反应:
混匀配制的反应mix,短暂离心后在42℃反应60min, 再进行85℃ 5min灭活处理。 所得的单链cDNA 放置于-20℃保存。

12、qPCR 检测miRNA.
miRNA检测引物设计:miRNA qPCR Detection Kit 中已提供有miRNA检测的Reverse 通用引物:“Universal adaptor PCR Primer”,Forward 检测引物需客户参考miRNA序列自行设计或直接从我公司定购以验证的引物。因为miRNA序列长度一般都在18~24nt之间,所以其检测的 Forward 检测引物一般都直接选用其miRNA序列或为增加其检测的特异性而特殊设计的序列:如有的miRNA GC含量偏高或引物易形成引物二聚体,其引物可为miRNA 3’端去除几个碱基后整理的序列。
miRNA qPCR Forward Primer 设计举例(以小鼠mmu-miR-125b-5p为例):
在miRNA Database中查找检测的miRNA序列,如下图所示:
miRNA Database:http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtmL



则其Forward 检测引物可为:

miRNA sequence  ucccugagacccuaacuuguga
Primer sequence   tccctgagaccctaacttgtga (Tm:58.8)

融解2×qPCR mix(如有必要,融解50×ROX Reference Dye)上下轻微颠倒混匀,短暂离心后放置冰上待用。冰上进行qPCR反应液的配制(所有miRNA进行复孔测试,同时进行单孔NTC(No template control)测试)

试剂组分   体积   终浓度
2×qPCR Mix  10μL   1×
qPCR Forward Primer(2μM)   2μL  0.2μM
Universal Adaptor PCR (2μM)   2μL  0.2μM
1st strand cDNA(diluted 1:5)   2μL  
ddH2O  4μL  
Final Volume  20μL  

1)2×qPCR Mix设定为总反应体积的一半,其它组分请按最适比例进行调整。如需变更总反应体积,请保持最适条件下各组分的比例。
2)Rox Reference Dye使用在需要用Rox 校正的Real-Time PCR仪,如ABI的定量PCR仪。
3)引物终浓度可在0.2μM~0.4μM范围内调整,一般条件下0.2μM的量即可达到理想的效果。
4)1st Strand cDNA 通常需要稀释后再使用 ,防止反转录体系对qPCR体系的影响。
5)充分混匀qPCR反应液,添加至PCR反应管中,短暂离心,确保所有试剂到反应管底部。
6)qPCR 反应,使用标准的三步法进行检测(以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计)。

循环数   步骤   温度   时间   检测
1  预变性   95℃   10min   否
  变性   95℃   10sec   否
40  退火   57℃   20sec   否
  延伸   72℃   10sec   是

对于用SYBR Green 染料法进行的qPCR的检测的反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析(以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计)

检测温度范围   升温速率   恒温时间   检测
70℃~95℃   0.5℃/次   6 sec/次   是
30℃      30sec   否

1)、2×qPCR Mix 中采用的DNA聚合酶为经过特殊修饰的热启动酶,95℃ 10min能充分的激活酶活性。
2)、因miRNA的特殊性从而导致了其引物的特殊性,在检测时应严格控制退火温度,防止出现非特异性扩增。
3)、进行反转录的Oligo dT Adaptor其长度为53nt,为此PCR扩增得到的片段长度一般在75bp左右(miRNA序列一般为22nt左右),所以延伸只需10sec即可。 对产物的融解曲线判断可以发现其Tm值一般都在79℃~83℃范围内,如果超出此范围,建议使用别的方法来验证产物的特异性(如电泳)。

以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5定量PCR仪器,如使用的为不同公司的定量PCR仪,请按照不同的仪器要求,调整延伸时间及其融解曲线分析的条件。

六:结果分析
20个miRNA及其内参U6的扩增曲线及其融解曲线结果

20个miRNA及其内参U6的电泳结果图及其检测原始平均Ct值



   Primer ID   Mature_ID   PCR_SIZE   组织   Sample Ave. Ct   胶泳道
1  hsmq-0031_01   has-miR-16   75  脑   27.02  1
2  hsmq-0032_01   hsa-miR-124   73  脑   22.98  2
3  hsmq-0033_01   hsa-miR-125a-5p   77  脑   27.81  3
4  hsmq-0034_01   hsa-miR-125b   75  脑   22.58  4
5  hsmq-0035_01   hsa-miR-137   76  脑   28.51  5
6  hsmq-0036_01   hsa-miR-139-5p   75  脑   30.66  6
7  hsmq-0037_01   hsa-miR-145   76  脑   24.7  7
8  hsmq-0038_01   hsa-miR-149   76  脑   29.71  8
9  hsmq-0039_01   hsa-miR-153   75  脑   27.61  9
10  hsmq-0040_01   hsa-miR-154   75  脑   30.39  10
11  hsmq-0041_01   hsa-miR-182   77  脑   34.64  11
12  hsmq-0042_01   hsa-miR-183   75  脑   33.86  12
13  hsmq-0043_01   hsa-miR-190   75  脑   32.28  13
14  hsmq-0044_01   hsa-miR-219-5p   74  脑   28.16  14
15  hsmq-0045_01   hsa-miR-22   75  脑   24.09  15
16  hsmq-0046_01   hsa-miR-26a   75  脑   22.66  16
17  hsmq-0047_01   hsa-miR-29b   76  脑   26.72  17
18  hsmq-0048_01   hsa-miR-30c   76  脑   26.54  18
19  hsmq-0049_01   hsa-miR-9   76  脑   23.11  19
20  hsmq-0050_01   hsa-miR-99b   75  脑   27.06  20
21  hsnRNA-U6_01   M14486   81  脑   22.26  21
如有交流的,可以请联系殷春婷13031191229扣扣867959049
提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序