【交流】MIRNA(microRNA)检测实验流程(加polyA法

MIRNA(microRNA)检测实验流程(加polyA法)

一：概述

microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。

迄今为此，对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。miRNA qPCR Detection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR技术来对miRNA进行检测，其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。

以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit来对miRNA进行检测的实验操作流程：

二：背景资料

检测人脑组织中miRNA的表达。所选的miRNA及其扩增长度信息如下：

　 Primer ID Mature_Acc Mature_ID PCR_SIZE
1 hsmq-0031_01 MIMAT0000069 has-miR-16 75
2 hsmq-0032_01 MIMAT0000422 hsa-miR-124 73
3 hsmq-0033_01 MIMAT0000443 hsa-miR-125a-5p 77
4 hsmq-0034_01 MIMAT0000423 hsa-miR-125b 75
5 hsmq-0035_01 MIMAT0000429 hsa-miR-137 76
6 hsmq-0036_01 MIMAT0000250 hsa-miR-139-5p 75
7 hsmq-0037_01 MIMAT0000437 hsa-miR-145 76
8 hsmq-0038_01 MIMAT0000450 hsa-miR-149 76
9 hsmq-0039_01 MIMAT0000439 hsa-miR-153 75
10 hsmq-0040_01 MIMAT0000452 hsa-miR-154 75
11 hsmq-0041_01 MIMAT0000259 hsa-miR-182 77
12 hsmq-0042_01 MIMAT0000261 hsa-miR-183 75
13 hsmq-0043_01 MIMAT0000458 hsa-miR-190 75
14 hsmq-0044_01 MIMAT0000276 hsa-miR-219-5p 74
15 hsmq-0045_01 MIMAT0000077 hsa-miR-22 75
16 hsmq-0046_01 MIMAT0000082 hsa-miR-26a 75
17 hsmq-0047_01 MIMAT0000100 hsa-miR-29b 76
18 hsmq-0048_01 MIMAT0000244 hsa-miR-30c 76
19 hsmq-0049_01 MIMAT0000441 hsa-miR-9 76
20 hsmq-0050_01 MIMAT0000689 hsa-miR-99b 75
21 hsnRNA-U6_01 M14486 hsnRNA-U6 81

三：实验内容

RNA抽提、RNA 加“PolyA”处理、RNA反转录、定量PCR检测及其数据分析。

四：实验主要仪器和试剂

主要实验仪器:冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统 iQ5 Real Time PCR Detection System。

主要实验试剂:TRIzol（Invitrogen）、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、miRNA qPCR Detection Kit。

五：实验操作

前期准备:为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性，在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头，同时实验操作时，需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行Total RNA抽提。

1、样品处理:取50mg～200mg样品直接在液氮中研磨至粉末，再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中，反复振荡裂解组织细胞。

（Note：如为贴壁细胞，去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)，反复吹打裂解细胞，再收集TRIzol至离心管中；如为悬浮细胞，离心收集悬浮细胞，加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞）。

2、相分离:室温放置上述样品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子，剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品。

3、RNA沉淀:小心吸取上清液约450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中，混匀，12000g 冷冻离心10min（4℃）。

4、RNA洗涤:去上清，加入500μL 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（4℃），去上清，再稍离，吸去上清液。

5、RNA溶解:风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。

6、RNA浓度测定:吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后，在分光光度计Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。

Note：如为常规的分光光度计，注意比色杯测定时的最少所需体积量，取一定量的RNA，用DEPC水稀释约100倍左右，同时在紫外条件下测定OD260和OD280，再按照公式计算RNA浓度＝40ng/μL×OD260×稀释倍数）。

7、RNA电泳检测：

7.1 变性胶制备：取1.2g Agarose + 75mL去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。

7.2 电泳缓冲液配制(1×Mops)：取50mL10×Mops ，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中。

7.3 RNA样品处理：取RNA样品约3μL，最后补充DEPC水至15μL，65℃变性10min后立即冷却，加入2μL 10×RNA loading buffer 即可电泳。

7.4 RNA电泳：先把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶拍照。

8、RNA抽提结果:

8.1. RNA电泳图（取3ul RNA 样品）：

8.2 RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和OD 260/OD280。

RNA来源 RNA浓度(ng/ul ) OD 260/OD280
人脑组织 3470 1.9

9、miRNA 3’端进行加“Poly A”处理
融解加“PolyA”反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
PolyA Reaction 反应液的配制
在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积20μL

试剂组分 体积 终浓度
Total RNA 2μg
2.5U/μLPolyA Polymerase 1μL 2.5U
10×PolyA Polymerase Buffer 2μL 1×
10×rATP Solution 2μL 1×
ddH2O(RNase/DNase free) 补至20μL
在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。
Total RNA使用量可在100ng～10μg之间调整，如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在10ng～1μg之间调整。

10、PolyA反应：

混匀配制的反应mix，短暂离心后在37℃反应15min。所得的反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20℃短暂保存，如需长期保存建议存放于-80℃。

11、Poly A化的RNA进行反转录反应：

融解反转录反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。RNA-Primer Mix 的配制反应：
在冰上预冷的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μL
试剂组分 体积 终浓度
PolyA反应液 2μL 　
25×Oligo dT Adaptor 1μL 1×
ddH2O(RNase/DNasfree) 10μL 　
Final Volume 13μL 　
混匀RNA-Primer Mix，短暂离心，直接65℃变性10min后立即放置冰上至少2min。

配制反转录反应液：

在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL。
试剂组分 体积 终浓度
RNA-Primer Mix 13μL
5×RT Reaction Buffer 5μL 1×
25mM dNTP 1μL 1mM
25U/μL RNase Inhibitor 1μL 25U
200U/μL M-MLV RTase (RNase H free) 1μL 200U
ddH2O(RNase/DNase free) 4μL
Final Volume 25μL

反转录反应:

混匀配制的反应mix，短暂离心后在42℃反应60min, 再进行85℃ 5min灭活处理。 所得的单链cDNA 放置于-20℃保存。

12、qPCR 检测miRNA.

miRNA检测引物设计：miRNA qPCR Detection Kit 中已提供有miRNA检测的Reverse 通用引物：“Universal adaptor PCR Primer”，Forward 检测引物需客户参考miRNA序列自行设计或直接从我公司定购以验证的引物。

因为miRNA序列长度一般都在18～24nt之间，所以其检测的 Forward 检测引物一般都直接选用其miRNA序列或为增加其检测的特异性而特殊设计的序列：如有的miRNA GC含量偏高或引物易形成引物二聚体，其引物可为miRNA 3’端去除几个碱基后整理的序列。

则其Forward 检测引物可为：

miRNA sequence ucccugagacccuaacuuguga
Primer sequence tccctgagaccctaacttgtga （Tm：58.8）

融解2×qPCR mix(如有必要，融解50×ROX Reference Dye)上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。冰上进行qPCR反应液的配制（所有miRNA进行复孔测试，同时进行单孔NTC（No template control）测试）

试剂组分 体积 终浓度
2×qPCR Mix 10μL 1×
qPCR Forward Primer（2μM） 2μL 0.2μM
Universal Adaptor PCR （2μM） 2μL 0.2μM
1st strand cDNA（diluted 1:5） 2μL
ddH2O 4μL
Final Volume 20μL

1）2×qPCR Mix设定为总反应体积的一半，其它组分请按最适比例进行调整。如需变更总反应体积，请保持最适条件下各组分的比例。
2）Rox Reference Dye使用在需要用Rox 校正的Real-Time PCR仪，如ABI的定量PCR仪。
3）引物终浓度可在0.2μM～0.4μM范围内调整，一般条件下0.2μM的量即可达到理想的效果。
4）1st Strand cDNA 通常需要稀释后再使用 ，防止反转录体系对qPCR体系的影响。
5）充分混匀qPCR反应液，添加至PCR反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管底部。
6）qPCR 反应，使用标准的三步法进行检测（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）。

循环数 步骤 温度 时间 检测
1 预变性 95℃ 10min 否
变性 95℃ 10sec 否
40 退火 57℃ 20sec 否
延伸 72℃ 10sec 是

对于用SYBR Green 染料法进行的qPCR的检测的反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）

检测温度范围 升温速率 恒温时间 检测
70℃～95℃ 0.5℃/次 6 sec/次 是
30℃ 30sec 否

1）、2×qPCR Mix 中采用的DNA聚合酶为经过特殊修饰的热启动酶，95℃ 10min能充分的激活酶活性。
2）、因miRNA的特殊性从而导致了其引物的特殊性，在检测时应严格控制退火温度，防止出现非特异性扩增。
3）、进行反转录的Oligo dT Adaptor其长度为53nt，为此PCR扩增得到的片段长度一般在75bp左右（miRNA序列一般为22nt左右），所以延伸只需10sec即可。 对产物的融解曲线判断可以发现其Tm值一般都在79℃～83℃范围内，如果超出此范围，建议使用别的方法来验证产物的特异性（如电泳）。

以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5定量PCR仪器，如使用的为不同公司的定量PCR仪，请按照不同的仪器要求，调整延伸时间及其融解曲线分析的条件。

六:结果分析
20个miRNA及其内参U6的扩增曲线及其融解曲线结果

20个miRNA及其内参U6的电泳结果图及其检测原始平均Ct值

　 Primer ID Mature_ID PCR_SIZE 组织 Sample Ave. Ct 胶泳道
1 hsmq-0031_01 has-miR-16 75 脑 27.02 1
2 hsmq-0032_01 hsa-miR-124 73 脑 22.98 2
3 hsmq-0033_01 hsa-miR-125a-5p 77 脑 27.81 3
4 hsmq-0034_01 hsa-miR-125b 75 脑 22.58 4
5 hsmq-0035_01 hsa-miR-137 76 脑 28.51 5
6 hsmq-0036_01 hsa-miR-139-5p 75 脑 30.66 6
7 hsmq-0037_01 hsa-miR-145 76 脑 24.7 7
8 hsmq-0038_01 hsa-miR-149 76 脑 29.71 8
9 hsmq-0039_01 hsa-miR-153 75 脑 27.61 9
10 hsmq-0040_01 hsa-miR-154 75 脑 30.39 10
11 hsmq-0041_01 hsa-miR-182 77 脑 34.64 11
12 hsmq-0042_01 hsa-miR-183 75 脑 33.86 12
13 hsmq-0043_01 hsa-miR-190 75 脑 32.28 13
14 hsmq-0044_01 hsa-miR-219-5p 74 脑 28.16 14
15 hsmq-0045_01 hsa-miR-22 75 脑 24.09 15
16 hsmq-0046_01 hsa-miR-26a 75 脑 22.66 16
17 hsmq-0047_01 hsa-miR-29b 76 脑 26.72 17
18 hsmq-0048_01 hsa-miR-30c 76 脑 26.54 18
19 hsmq-0049_01 hsa-miR-9 76 脑 23.11 19
20 hsmq-0050_01 hsa-miR-99b 75 脑 27.06 20
21 hsnRNA-U6_01 M14486 81 脑 22.26 21

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