【共享】很有用的MIRNA(microRNA)检测实验流程(加polyA法）
丁香园论坛
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概述
microRNA(miRNA)是一类由大约22 个核苷酸组成的非编码小分子RNA，广泛存在于
真核生物中。miRNA 在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其
在发育和分化中起有重大的调控作用。
迄今为此，对miRNA 的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些
方法敏感度低、耗时长、RNA 的用量较大。miRNA Q-PCR Detection Kit 采用了国际上公认
的核酸检测标准技术――Real-Time PCR 技术来对miRNA 进行检测，具有快速、特异性强、
灵敏度高等优点。
miRNA Q-PCR Detection Kit 通过Poly A Polymerase 对miRNA 3’端进行加“Poly A”
处理，同时利用M-MLV RTase 及独特的Oligo dT Adaptor 对Poly A 化的RNA 进行反转录，
最后采用含有SYBR Green 的AllinOne TM Q-PCR Mix 对miRNA 进行特异性检测。
方法背景介绍：（加Poly A法）
方法特征：
检测简便、快捷、节约：miRNA qPCR Detection System是基于SYBR Green染料法的qPCR检测系统，可用于从一个合成反应的cDNA中检测多种miRNAs，不仅减少了误差、节约了样品，同时还实现了检测的高通量 。
检测的特异性：独特的miRNA引物设计技术及其优化的反应体系避免了非特异性扩增、特别是Pre-miRNA的污染
检测分辨率高：该系统能分辨单碱基差异的miRNA
一站式解决方案：GeneCopoeia 不仅提供检测的试剂盒，还提供经验证的人源、小鼠源、大鼠源的特异性miRNA 检测引物。
检测灵敏度高：可在低至pg级的总RNA中检测到特异表达的miRNA。
一．实验材料及其仪器
1．实验仪器
iQ5 Real Time PCR Detection System： Bio-Rad
2．实验材料及试剂
All-in-OneTM miRNA Q-PCR Detection Kit： GeneCopoeia (Cat. No. R0101S )
验证模板：人源十个不同的组织所制备的cDNA
测试引物：共5 对（具体引物序列等详细信息附在产品说明书处，此处略）
验证引物来源于GeneCopoeia 公司 www.fulengen.com
二：验证流程及其条件
RNA 抽提
1． 样品处理
取一定量的十个不同的人源组织标本至冷冻的研钵中，加入液氮研磨至细粉，最
后转移至有1ml TRIzol 的离心管中，反复振荡约5min。（如为细胞样品，则取约
106~107 左右的细胞数至1ml TRIzol 中，反复吹打至裂解。）
2． 相分离
室温放置10min 左右后，每1ml TRIzol 中加入氯仿为200μl，盖上盖子，剧烈振
荡约1min，室温静置2～5min，然后12000g 冷冻离心15min（6℃），小心取出样品，
通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA 样品。
3． RNA 沉淀
小心吸取上清液约450μl（每1ml TRIzol 的吸取量）至含有600μl 冷冻异丙醇的新
离心管中，混匀，-20℃放置约10min，12000g 冷冻离心10min（6℃）。
4． RNA 洗涤
去上清，加入500μl 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（6℃），
去上清，再稍离，吸去上清液。
5． RNA 溶解
风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC 水约30μl。
贴上标签后-80℃保存。
6．RNA 浓度测定
吸取1μl 抽提的RNA 用DEPC 水稀释10 倍后，在Nanodrop 上测定RNA 浓度，
以DEPC 水做空白对照，同时记录RNA 浓度及其OD260/OD280。
7．RNA 电泳检测
7.1．变性胶制备
取1g Agarose + 75ml 去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10ml 10×Mops 和15ml
甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。
7.2．电泳缓冲液配制(1×Mops)
取50ml 10×Mops ，用去离子水稀释至500ml，倒入电泳槽中，再在电泳缓冲液中
添加EB.
7.3．RNA 样品处理
取RNA 样品3μl，补充DEPC 水至18μl，65℃变性10min 后立即冷却，加入2μl
10×RNA loading buffer 即可电泳
7.4．RNA 电泳
先把RNA 胶放入电泳槽中，100V 作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的
RNA 样品，100V 左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3 处，取胶拍照。
8．RNA 检测结果
8.1. 十个不同组织的RNA 电泳图（取各3μl RNA 样品）：
8.2 RNA 电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和OD260/OD280
注：抽提的RNA 必须含有小分子RNA 才能进行miRNA 的检测，所以所选的试剂盒必须为总RNA
抽提试剂盒或小分子RNA 抽提试剂盒； 同时RNA 抽提的质量是进行下游实验的关键，敬请严
格按照所使用的RNA 抽提试剂盒要求进行抽提，抽提结束后，敬请电泳检测RNA 抽提质量。
miRNA 反转录反应
a. 融解miRNA 反转录所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
b. miRNA 反转录反应液的配制
在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积25μl
※ 在反应中使用的total RNA 必须含有小分子RNA。
※ Total RNA 使用量可在1ng～5μg 之间调整, 如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在0.1ng～1μg 之间调整。
c. 反转录反应
混匀配制的反应mix，短暂离心后在37℃反应60min，结束后再进行85℃ 5min 灭
活处理。所得的反转录产物可用灭菌水稀释5 倍进行下游qPCR 实验。
Q-PCR 检测miRNA
1. 融解All-in-OneTM miRNA Q-PCR Detection Kit 中的2×All-in-OneTM Q-PCR mix 上下轻
微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
2. 冰上进行Q-PCR 反应液的配制（所有miRNA 进行复孔测试，同时进行单孔NTC（No
template control）测试）
注：在实验中设计了NTC（No Template Control），其为阴性对照，即用水来代替模板cDNA，其它试剂不变，从而来质控是否体系有污染；实验中如需更改反应体积，敬请保持最适条件下各组分的比例；试剂盒中的Rox Reference Dye 使用在需用Rox 校正的仪器，如ABI 的定量PCR
仪
3. 充分混匀Q-PCR 反应液，添加至PCR 反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管
底部。
4. Q-PCR 反应，使用标准的三步法进行检测（以Bio-Rad 的iQ5 进行实验的设计）
反应结束后，立即进行融解曲线分析
注： 以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5 定量PCR 仪器，如使用的为不同公司的定量
PCR 仪，请按照不同的仪器要求，调整延伸时间及其融解曲线分析的条件；各miRNA 的退
火问题可能例有差别，具体请参考测试结果部分。如果使用验证引物一般设计的退火温度为60℃
三：测试结果
1. hsa-miR-16（hsmq-0031 引物）
推荐退火问题：60℃
hsa-miR-16 扩增曲线示意图 hsa-miR-16 融解曲线示意图
2．hsa-miR-124（hsmq-0032 引物）
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-124 扩增曲线示意图 hsa-miR-124 融解曲线示意图
3．hsa-miR-125b(hsmq-0034 引物)
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-125b 扩增曲线示意图 hsa-miR-125b 融解曲线示意图
4．hsa-miR-137(hsmq-0035 引物)
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-137 扩增曲线示意图 hsa-miR-137 融解曲线示意图
5．hsnRNA U6 引物测试
推荐退火温度：60℃
hsnRNA U6 扩增曲线示意图 hsnRNA U6 融解曲线示意图
6. 电泳结果
取5μl PCR 产物进行电泳，胶浓度（3％），所有检测都为两个阳性，一个NTC
其中泳道1 为hsa-miR-16、泳道2 为hsa-miR-124、泳道3 为hsa-miR-125b、泳道4 为
hsa-miR-137、泳道5 为hsnRNA-U6[img]
microRNA(miRNA)是一类由大约22 个核苷酸组成的非编码小分子RNA，广泛存在于
真核生物中。miRNA 在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其
在发育和分化中起有重大的调控作用。
迄今为此，对miRNA 的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些
方法敏感度低、耗时长、RNA 的用量较大。miRNA Q-PCR Detection Kit 采用了国际上公认
的核酸检测标准技术――Real-Time PCR 技术来对miRNA 进行检测，具有快速、特异性强、
灵敏度高等优点。
miRNA Q-PCR Detection Kit 通过Poly A Polymerase 对miRNA 3’端进行加“Poly A”
处理，同时利用M-MLV RTase 及独特的Oligo dT Adaptor 对Poly A 化的RNA 进行反转录，
最后采用含有SYBR Green 的AllinOne TM Q-PCR Mix 对miRNA 进行特异性检测。
方法背景介绍：（加Poly A法）
方法特征：
检测简便、快捷、节约：miRNA qPCR Detection System是基于SYBR Green染料法的qPCR检测系统，可用于从一个合成反应的cDNA中检测多种miRNAs，不仅减少了误差、节约了样品，同时还实现了检测的高通量 。
检测的特异性：独特的miRNA引物设计技术及其优化的反应体系避免了非特异性扩增、特别是Pre-miRNA的污染
检测分辨率高：该系统能分辨单碱基差异的miRNA
一站式解决方案：GeneCopoeia 不仅提供检测的试剂盒，还提供经验证的人源、小鼠源、大鼠源的特异性miRNA 检测引物。
检测灵敏度高：可在低至pg级的总RNA中检测到特异表达的miRNA。
一．实验材料及其仪器
1．实验仪器
iQ5 Real Time PCR Detection System： Bio-Rad
2．实验材料及试剂
All-in-OneTM miRNA Q-PCR Detection Kit： GeneCopoeia (Cat. No. R0101S )
验证模板：人源十个不同的组织所制备的cDNA
测试引物：共5 对（具体引物序列等详细信息附在产品说明书处，此处略）
验证引物来源于GeneCopoeia 公司 www.fulengen.com
二：验证流程及其条件
RNA 抽提
1． 样品处理
取一定量的十个不同的人源组织标本至冷冻的研钵中，加入液氮研磨至细粉，最
后转移至有1ml TRIzol 的离心管中，反复振荡约5min。（如为细胞样品，则取约
106~107 左右的细胞数至1ml TRIzol 中，反复吹打至裂解。）
2． 相分离
室温放置10min 左右后，每1ml TRIzol 中加入氯仿为200μl，盖上盖子，剧烈振
荡约1min，室温静置2～5min，然后12000g 冷冻离心15min（6℃），小心取出样品，
通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA 样品。
3． RNA 沉淀
小心吸取上清液约450μl（每1ml TRIzol 的吸取量）至含有600μl 冷冻异丙醇的新
离心管中，混匀，-20℃放置约10min，12000g 冷冻离心10min（6℃）。
4． RNA 洗涤
去上清，加入500μl 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（6℃），
去上清，再稍离，吸去上清液。
5． RNA 溶解
风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC 水约30μl。
贴上标签后-80℃保存。
6．RNA 浓度测定
吸取1μl 抽提的RNA 用DEPC 水稀释10 倍后，在Nanodrop 上测定RNA 浓度，
以DEPC 水做空白对照，同时记录RNA 浓度及其OD260/OD280。
7．RNA 电泳检测
7.1．变性胶制备
取1g Agarose + 75ml 去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10ml 10×Mops 和15ml
甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。
7.2．电泳缓冲液配制(1×Mops)
取50ml 10×Mops ，用去离子水稀释至500ml，倒入电泳槽中，再在电泳缓冲液中
添加EB.
7.3．RNA 样品处理
取RNA 样品3μl，补充DEPC 水至18μl，65℃变性10min 后立即冷却，加入2μl
10×RNA loading buffer 即可电泳
7.4．RNA 电泳
先把RNA 胶放入电泳槽中，100V 作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的
RNA 样品，100V 左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3 处，取胶拍照。
8．RNA 检测结果
8.1. 十个不同组织的RNA 电泳图（取各3μl RNA 样品）：
8.2 RNA 电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和OD260/OD280
注：抽提的RNA 必须含有小分子RNA 才能进行miRNA 的检测，所以所选的试剂盒必须为总RNA
抽提试剂盒或小分子RNA 抽提试剂盒； 同时RNA 抽提的质量是进行下游实验的关键，敬请严
格按照所使用的RNA 抽提试剂盒要求进行抽提，抽提结束后，敬请电泳检测RNA 抽提质量。
miRNA 反转录反应
a. 融解miRNA 反转录所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
b. miRNA 反转录反应液的配制
在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积25μl
※ 在反应中使用的total RNA 必须含有小分子RNA。
※ Total RNA 使用量可在1ng～5μg 之间调整, 如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在0.1ng～1μg 之间调整。
c. 反转录反应
混匀配制的反应mix，短暂离心后在37℃反应60min，结束后再进行85℃ 5min 灭
活处理。所得的反转录产物可用灭菌水稀释5 倍进行下游qPCR 实验。
Q-PCR 检测miRNA
1. 融解All-in-OneTM miRNA Q-PCR Detection Kit 中的2×All-in-OneTM Q-PCR mix 上下轻
微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
2. 冰上进行Q-PCR 反应液的配制（所有miRNA 进行复孔测试，同时进行单孔NTC（No
template control）测试）
注：在实验中设计了NTC（No Template Control），其为阴性对照，即用水来代替模板cDNA，其它试剂不变，从而来质控是否体系有污染；实验中如需更改反应体积，敬请保持最适条件下各组分的比例；试剂盒中的Rox Reference Dye 使用在需用Rox 校正的仪器，如ABI 的定量PCR
仪
3. 充分混匀Q-PCR 反应液，添加至PCR 反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管
底部。
4. Q-PCR 反应，使用标准的三步法进行检测（以Bio-Rad 的iQ5 进行实验的设计）
反应结束后，立即进行融解曲线分析
注： 以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5 定量PCR 仪器，如使用的为不同公司的定量
PCR 仪，请按照不同的仪器要求，调整延伸时间及其融解曲线分析的条件；各miRNA 的退
火问题可能例有差别，具体请参考测试结果部分。如果使用验证引物一般设计的退火温度为60℃
三：测试结果
1. hsa-miR-16（hsmq-0031 引物）
推荐退火问题：60℃
hsa-miR-16 扩增曲线示意图 hsa-miR-16 融解曲线示意图
2．hsa-miR-124（hsmq-0032 引物）
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-124 扩增曲线示意图 hsa-miR-124 融解曲线示意图
3．hsa-miR-125b(hsmq-0034 引物)
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-125b 扩增曲线示意图 hsa-miR-125b 融解曲线示意图
4．hsa-miR-137(hsmq-0035 引物)
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-137 扩增曲线示意图 hsa-miR-137 融解曲线示意图
5．hsnRNA U6 引物测试
推荐退火温度：60℃
hsnRNA U6 扩增曲线示意图 hsnRNA U6 融解曲线示意图
6. 电泳结果
取5μl PCR 产物进行电泳，胶浓度（3％），所有检测都为两个阳性，一个NTC
其中泳道1 为hsa-miR-16、泳道2 为hsa-miR-124、泳道3 为hsa-miR-125b、泳道4 为
hsa-miR-137、泳道5 为hsnRNA-U6[img]
