MIRNA(microRNA)检测实验流程(加polyA法)

互联网2012-03-09

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一：概述

microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此，对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。miRNA qPCR Detection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR技术来对miRNA进行检测，其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。

以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit来对miRNA进行检测的实验操作流程：

二：背景资料

检测人脑组织中miRNA的表达。所选的miRNA及其扩增长度信息如下：

	Primer ID	Mature_Acc	Mature_ID	PCR_SIZE
1	hsmq-0031_01	MIMAT0000069	has-miR-16	75
2	hsmq-0032_01	MIMAT0000422	hsa-miR-124	73
3	hsmq-0033_01	MIMAT0000443	hsa-miR-125a-5p	77
4	hsmq-0034_01	MIMAT0000423	hsa-miR-125b	75
5	hsmq-0035_01	MIMAT0000429	hsa-miR-137	76
6	hsmq-0036_01	MIMAT0000250	hsa-miR-139-5p	75
7	hsmq-0037_01	MIMAT0000437	hsa-miR-145	76
8	hsmq-0038_01	MIMAT0000450	hsa-miR-149	76
9	hsmq-0039_01	MIMAT0000439	hsa-miR-153	75
10	hsmq-0040_01	MIMAT0000452	hsa-miR-154	75
11	hsmq-0041_01	MIMAT0000259	hsa-miR-182	77
12	hsmq-0042_01	MIMAT0000261	hsa-miR-183	75
13	hsmq-0043_01	MIMAT0000458	hsa-miR-190	75
14	hsmq-0044_01	MIMAT0000276	hsa-miR-219-5p	74
15	hsmq-0045_01	MIMAT0000077	hsa-miR-22	75
16	hsmq-0046_01	MIMAT0000082	hsa-miR-26a	75
17	hsmq-0047_01	MIMAT0000100	hsa-miR-29b	76
18	hsmq-0048_01	MIMAT0000244	hsa-miR-30c	76
19	hsmq-0049_01	MIMAT0000441	hsa-miR-9	76
20	hsmq-0050_01	MIMAT0000689	hsa-miR-99b	75
21	hsnRNA-U6_01	M14486	hsnRNA-U6	81

三：实验内容

RNA抽提、RNA 加“PolyA”处理、RNA反转录、定量PCR检测及其数据分析。

四：实验主要仪器和试剂

主要实验仪器:冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统 iQ5 Real Time PCR Detection System。

主要实验试剂:TRIzol（Invitrogen）、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、miRNA qPCR Detection Kit。

五：实验操作

前期准备:为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性，在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头，同时实验操作时，需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行Total RNA抽提。

1、样品处理:取50mg～200mg样品直接在液氮中研磨至粉末，再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中，反复振荡裂解组织细胞。（Note：如为贴壁细胞，去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)，反复吹打裂解细胞，再收集TRIzol至离心管中；如为悬浮细胞，离心收集悬浮细胞，加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞）。

2、相分离:室温放置上述样品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子，剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品。

3、RNA沉淀:小心吸取上清液约450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中，混匀，12000g 冷冻离心10min（4℃）。

4、RNA洗涤:去上清，加入500μL 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（4℃），去上清，再稍离，吸去上清液。

5、RNA溶解:风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。

6、RNA浓度测定:吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后，在分光光度计Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。Note：如为常规的分光光度计，注意比色杯测定时的最少所需体积量，取一定量的RNA，用DEPC水稀释约100倍左右，同时在紫外条件下测定OD260和OD280，再按照公式计算RNA浓度＝40ng/μL×OD260×稀释倍数）。

7、RNA电泳检测：

7.1 变性胶制备：取1.2g Agarose + 75mL去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。

7.2 电泳缓冲液配制(1×Mops)：取50mL10×Mops ，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中。

7.3 RNA样品处理：取RNA样品约3μL，最后补充DEPC水至15μL，65℃变性10min后立即冷却，加入2μL 10×RNA loading buffer 即可电泳。

7.4 RNA电泳：先把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶拍照。