MIRNA(microRNA)检测实验流程(加polyA法)
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一:概述
microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA,其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式,都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此,对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法,这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。miRNA qPCR Detection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR技术来对miRNA进行检测,其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。
以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit来对miRNA进行检测的实验操作流程:
二:背景资料
检测人脑组织中miRNA的表达。所选的miRNA及其扩增长度信息如下:
Primer ID | Mature_Acc | Mature_ID | PCR_SIZE | |
1 | hsmq-0031_01 | MIMAT0000069 | has-miR-16 | 75 |
2 | hsmq-0032_01 | MIMAT0000422 | hsa-miR-124 | 73 |
3 | hsmq-0033_01 | MIMAT0000443 | hsa-miR-125a-5p | 77 |
4 | hsmq-0034_01 | MIMAT0000423 | hsa-miR-125b | 75 |
5 | hsmq-0035_01 | MIMAT0000429 | hsa-miR-137 | 76 |
6 | hsmq-0036_01 | MIMAT0000250 | hsa-miR-139-5p | 75 |
7 | hsmq-0037_01 | MIMAT0000437 | hsa-miR-145 | 76 |
8 | hsmq-0038_01 | MIMAT0000450 | hsa-miR-149 | 76 |
9 | hsmq-0039_01 | MIMAT0000439 | hsa-miR-153 | 75 |
10 | hsmq-0040_01 | MIMAT0000452 | hsa-miR-154 | 75 |
11 | hsmq-0041_01 | MIMAT0000259 | hsa-miR-182 | 77 |
12 | hsmq-0042_01 | MIMAT0000261 | hsa-miR-183 | 75 |
13 | hsmq-0043_01 | MIMAT0000458 | hsa-miR-190 | 75 |
14 | hsmq-0044_01 | MIMAT0000276 | hsa-miR-219-5p | 74 |
15 | hsmq-0045_01 | MIMAT0000077 | hsa-miR-22 | 75 |
16 | hsmq-0046_01 | MIMAT0000082 | hsa-miR-26a | 75 |
17 | hsmq-0047_01 | MIMAT0000100 | hsa-miR-29b | 76 |
18 | hsmq-0048_01 | MIMAT0000244 | hsa-miR-30c | 76 |
19 | hsmq-0049_01 | MIMAT0000441 | hsa-miR-9 | 76 |
20 | hsmq-0050_01 | MIMAT0000689 | hsa-miR-99b | 75 |
21 | hsnRNA-U6_01 | M14486 | hsnRNA-U6 | 81 |
RNA抽提、RNA 加“PolyA”处理、RNA反转录、定量PCR检测及其数据分析。
四:实验主要仪器和试剂
主要实验仪器:冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统 iQ5 Real Time PCR Detection System。
主要实验试剂:TRIzol(Invitrogen)、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、miRNA qPCR Detection Kit。
五:实验操作
前期准备:为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性,在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头,同时实验操作时,需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行Total RNA抽提。
1、样品处理:取50mg~200mg样品直接在液氮中研磨至粉末,再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中,反复振荡裂解组织细胞。(Note:如为贴壁细胞,去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol),反复吹打裂解细胞,再收集TRIzol至离心管中;如为悬浮细胞,离心收集悬浮细胞,加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞)。
2、相分离:室温放置上述样品液10min左右后,每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL,盖上盖子,剧烈振荡约1min,室温静置5min,然后12000g 冷冻离心15min(4℃),小心取出样品,通过观察可以发现样品分三层,其中最上层含有RNA样品。
3、RNA沉淀:小心吸取上清液约450μL(每1mLTRIzol 的吸取量)至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中,混匀,12000g 冷冻离心10min(4℃)。
4、RNA洗涤:去上清,加入500μL 冷冻的75%乙醇,弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min(4℃),去上清,再稍离,吸去上清液。
5、RNA溶解:风干约5~10min(注意不能风太干,只需要沉淀泛白即可),加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。
6、RNA浓度测定:吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后,在分光光度计Nanodrop上测定RNA浓度,以DEPC水做空白对照,同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。Note:如为常规的分光光度计,注意比色杯测定时的最少所需体积量,取一定量的RNA,用DEPC水稀释约100倍左右,同时在紫外条件下测定OD260和OD280,再按照公式计算RNA浓度=40ng/μL×OD260×稀释倍数)。
7、RNA电泳检测:
7.1 变性胶制备:取1.2g Agarose + 75mL去离子水煮沸,冷却至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上,盖上盖子。
7.2 电泳缓冲液配制(1×Mops):取50mL10×Mops ,用去离子水稀释至500mL,倒入电泳槽中。
7.3 RNA样品处理:取RNA样品约3μL,最后补充DEPC水至15μL,65℃变性10min后立即冷却,加入2μL 10×RNA loading buffer 即可电泳。
7.4 RNA电泳:先把RNA胶放入电泳槽中,100V作用电泳约5min,再在点样孔中点入处理过的RNA样品,100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处,取胶拍照。