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【原创】实验日志:酵母双杂交

丁香园

2759
开始做酵母双杂交了,计划用一个膜蛋白去筛库,已经做好了工作量大,而预期结果要靠点小运气的心理准备,面前真是一条很长的路要走!
在丁香园学习了很久,希望能将我这次试验过程中遇到的困难和思索记录下来,跟大家一同讨论,共同学习。
今天先说说实验之前的试剂准备,为了保证实验能顺利进行,我选择了clontech的matchmaker gold系统,订购了人脑cDNA文库(标准化的),还有培养基也是订的商品化的,再有一个提酵母质粒的KIT

1,GOLD系统式对系统3的升级版,替换了一个报告基因,新加入了一种新的真菌抗生素,可能叫金担子素A吧,降低了平板的背景,和假阳性结果。 另外系统自带了一个转化酵母的试剂盒。
2,人脑cDNA文库,标准化的意思是降低了很多管家基因的表达水平,这样一来库内的各种基因表达水平比较均等,我是这样理解的,这个文库一共5支,每支1ml,每筛一次就要用去一支,还是很珍贵的。打了85折下来,也要10000块左右。
3,培养基用的很快,但是因为第一次接触酵母,为了保险起见,也咬牙买了

这么多的前期准备,花了大概25000的样子,都是打了85折
直接找clontech的北京代理‘六合通’公司订购的,他们的技术支持很敬业,所以顺便推荐一下

对照试验
东西到了之后,首先打算做对照试验
pGBKT7-53 + pGADT7-T 作为阳性对照
pGBKT7-Lam+pGADT7-T 作为阴性对照
(高压培养基的时候,没有预先打听清楚,高压条件,就跟普通LB一样送到高压室去了,结果高压时间过长,导致葡萄糖深度焦化,YPDA变成了很深的酒红色,只好重新再来。损失呀!!!!第二次,严格按照说明书自己高压 121° 15min,可是结果颜色看起来还是有那么一点发红,硬着头皮用于转化,结果有转化子长出来,只是转化效率很低,打算下次115° 20min 试一试)
从-80°取菌种,划线,30° 培养3天,长出了很多克隆。酵母的克隆与大肠杆菌克隆相比,更大,乳白色,看起来表面光滑而湿润,把平板用封口膜封好,4°冰箱保存,防止霉菌污染。

第一次尝试转化实验,转化效率不高,T(SD/-Leu)1:10长出大概不到50个克隆,而另外两个质粒的转化子更差,还有个奇怪的现象,2天的时候克隆直径不到2MM,还是乳白色的,长到第3天后居然变成粉红色的了,有的板红色的程度更深一些

查资料,考虑有2个原因:1,长的时间太长,菌种老化了
2,培养板上的Ade含量不足,产生了代谢产物是粉红色的
重复转化一次再看看
下次的改进:感受态的制备过程更注意无菌操作,冰水浴上进行,同时用感受态涂YPDA平板,以验证感受态细胞的质量如何

另外筛库用的重组质粒也在同步构建
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