【原创】实验日志：酵母双杂交
丁香园论坛
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开始做酵母双杂交了，计划用一个膜蛋白去筛库，已经做好了工作量大，而预期结果要靠点小运气的心理准备，面前真是一条很长的路要走！
在丁香园学习了很久，希望能将我这次试验过程中遇到的困难和思索记录下来，跟大家一同讨论，共同学习。
今天先说说实验之前的试剂准备，为了保证实验能顺利进行，我选择了clontech的matchmaker gold系统，订购了人脑cDNA文库（标准化的），还有培养基也是订的商品化的，再有一个提酵母质粒的KIT
1，GOLD系统式对系统3的升级版，替换了一个报告基因，新加入了一种新的真菌抗生素，可能叫金担子素A吧，降低了平板的背景，和假阳性结果。 另外系统自带了一个转化酵母的试剂盒。
2，人脑cDNA文库，标准化的意思是降低了很多管家基因的表达水平，这样一来库内的各种基因表达水平比较均等，我是这样理解的，这个文库一共5支，每支1ml，每筛一次就要用去一支，还是很珍贵的。打了85折下来，也要10000块左右。
3，培养基用的很快，但是因为第一次接触酵母，为了保险起见，也咬牙买了
这么多的前期准备，花了大概25000的样子，都是打了85折
直接找clontech的北京代理‘六合通’公司订购的，他们的技术支持很敬业，所以顺便推荐一下
对照试验
东西到了之后，首先打算做对照试验
pGBKT7-53 + pGADT7-T 作为阳性对照
pGBKT7-Lam+pGADT7-T 作为阴性对照
（高压培养基的时候，没有预先打听清楚，高压条件，就跟普通LB一样送到高压室去了，结果高压时间过长，导致葡萄糖深度焦化，YPDA变成了很深的酒红色，只好重新再来。损失呀！！！！第二次，严格按照说明书自己高压 121° 15min,可是结果颜色看起来还是有那么一点发红，硬着头皮用于转化，结果有转化子长出来，只是转化效率很低，打算下次115° 20min 试一试）
从-80°取菌种，划线，30° 培养3天，长出了很多克隆。酵母的克隆与大肠杆菌克隆相比，更大，乳白色，看起来表面光滑而湿润，把平板用封口膜封好，4°冰箱保存，防止霉菌污染。
第一次尝试转化实验，转化效率不高，T（SD/-Leu）1：10长出大概不到50个克隆，而另外两个质粒的转化子更差，还有个奇怪的现象，2天的时候克隆直径不到2MM，还是乳白色的，长到第3天后居然变成粉红色的了，有的板红色的程度更深一些
查资料，考虑有2个原因：1，长的时间太长，菌种老化了
2，培养板上的Ade含量不足，产生了代谢产物是粉红色的
重复转化一次再看看
下次的改进：感受态的制备过程更注意无菌操作，冰水浴上进行，同时用感受态涂YPDA平板，以验证感受态细胞的质量如何
另外筛库用的重组质粒也在同步构建
在丁香园学习了很久，希望能将我这次试验过程中遇到的困难和思索记录下来，跟大家一同讨论，共同学习。
今天先说说实验之前的试剂准备，为了保证实验能顺利进行，我选择了clontech的matchmaker gold系统，订购了人脑cDNA文库（标准化的），还有培养基也是订的商品化的，再有一个提酵母质粒的KIT
1，GOLD系统式对系统3的升级版，替换了一个报告基因，新加入了一种新的真菌抗生素，可能叫金担子素A吧，降低了平板的背景，和假阳性结果。 另外系统自带了一个转化酵母的试剂盒。
2，人脑cDNA文库，标准化的意思是降低了很多管家基因的表达水平，这样一来库内的各种基因表达水平比较均等，我是这样理解的，这个文库一共5支，每支1ml，每筛一次就要用去一支，还是很珍贵的。打了85折下来，也要10000块左右。
3，培养基用的很快，但是因为第一次接触酵母，为了保险起见，也咬牙买了
这么多的前期准备，花了大概25000的样子，都是打了85折
直接找clontech的北京代理‘六合通’公司订购的，他们的技术支持很敬业，所以顺便推荐一下
对照试验
东西到了之后，首先打算做对照试验
pGBKT7-53 + pGADT7-T 作为阳性对照
pGBKT7-Lam+pGADT7-T 作为阴性对照
（高压培养基的时候，没有预先打听清楚，高压条件，就跟普通LB一样送到高压室去了，结果高压时间过长，导致葡萄糖深度焦化，YPDA变成了很深的酒红色，只好重新再来。损失呀！！！！第二次，严格按照说明书自己高压 121° 15min,可是结果颜色看起来还是有那么一点发红，硬着头皮用于转化，结果有转化子长出来，只是转化效率很低，打算下次115° 20min 试一试）
从-80°取菌种，划线，30° 培养3天，长出了很多克隆。酵母的克隆与大肠杆菌克隆相比，更大，乳白色，看起来表面光滑而湿润，把平板用封口膜封好，4°冰箱保存，防止霉菌污染。
第一次尝试转化实验，转化效率不高，T（SD/-Leu）1：10长出大概不到50个克隆，而另外两个质粒的转化子更差，还有个奇怪的现象，2天的时候克隆直径不到2MM，还是乳白色的，长到第3天后居然变成粉红色的了，有的板红色的程度更深一些
查资料，考虑有2个原因：1，长的时间太长，菌种老化了
2，培养板上的Ade含量不足，产生了代谢产物是粉红色的
重复转化一次再看看
下次的改进：感受态的制备过程更注意无菌操作，冰水浴上进行，同时用感受态涂YPDA平板，以验证感受态细胞的质量如何
另外筛库用的重组质粒也在同步构建
