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蛋白纯化经验指南（）
摘自中国色谱网
1) 白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。
请我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60％左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用0.5％CHAPS助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。
既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了，我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液PH值，看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。
2) 请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶？
亲和的填料合成过20来种,你是希望用它来纯化某种脱氢酶吗,我看FMN可偶联的有限,倒是FAD有活泼的氨基好偶联,何况它们几乎是同一个辅酶,你是不是考虑把FAD连上去.当然FMN的结构上也有个仲胺,可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上,而溴化氰活化或别的活化的介质都不大好,因此我觉得这个没有什么问题.
此外如果是以FMN为辅酶的,那我还可以建议 你试试蓝色琼脂糖凝胶,因为它的配基的结构和FMN的三个环很相似,它能纯化不少脱氢酶和激酶.如果它可以你就不需要合成填料了,有现成的.
我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择自己适合的活化介质。
不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。
我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定，配基脱落少。我觉得是不错的选择。
包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说.我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件.
层析复性很时髦,但是真正能用的不很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。
3) Sephadex G-25（medium）柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗？若有，一般对盐浓度限度如何？
大家别客气，除盐对于浓度应该也是有一定的限制的，同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，但是在正常的范围如1-2M应该影响不大，不过要除得很干净还是尽量少上点样品，我觉得上样的体积毕竟比浓度的影响更大。
4) 我的蛋白17kd左右，能跟肝素亲和，一般用离子交换和亲和层析纯化，
现在我用聚乙二醇修饰它 ，分子量增加5000左右，修饰率不可能达到100％，请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开？（当然修饰后还残留有聚乙二醇，这个小分子也要除掉）
他们大多用凝胶过滤，我觉得这也不错的做法，毕竟PEG是链状的分子，在柱子上和普通蛋白行为不一样，修饰度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白选择sephadex G50试试，它的范围在1000-30000，应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链，修饰后的蛋白疏水性增强，修饰度越高，疏水性越强，可以用这个原理分离。离子交换也可以选择，因为同样道理，修饰度越高，电荷被屏蔽也越多，电荷也越少，因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的道理，你可以试试，你手头的亲和能不能分开，你在这几个方法里选择看哪个更经济好用就可以。
5) 我是个新手，谢谢楼主给我解决了许多难题。
我有个问题困绕很久，从细菌中提取酶，好象用常规的方法（超声波破壁，缓冲液提取），总是拿不到我要的蛋白。是不是这种蛋白也是疏岁水性较强，需要加助溶剂才能提取出来？另外，我是不是也可以加点甘油或者PEG来提取？
其实这个问题我觉得是这样的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目标蛋白的分子量你是应该知道的，那么跑电泳先看它到底是在上清还是沉淀里，剩下的问题你再解决如何提取。
对于不同的酶要看酶稳定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾经提取一个酶用水就是提取不出来，需要用盐才能提取出来，多试试，设计个方案，这样才能解决问题，所以不一定加甘油就管用，你还得注意破碎本身会不会有问题，倒回去做做也许能找到真正的原因。有什么问题继续探讨。
6) HPLC是用来分析检测or分离纯化？
如果可以用来纯化，上样量那么小有什么意义呢？
如果是用来分析检测，怎样指导以后的分离纯化工作呢？
HPLC既可以做分析也可以做制备，纯化上样量小，这样分离效果好，就可能得到很纯的物质，同时配合质谱等就何以得到很多单一蛋白的特性包括序列等，这些纯度高的组分是用一般的纯化方法做不到的。HPLC重现性好,定量准确,所以也可以用于定量和定性,是分析中不可缺少的工具.
分析出来后如果这个物质很稳定，直接线性放大就可以做大规模的制备，因此摸好了分析的条件也就相应有了制备的条件。
7) 利用蔬水性质，用反向HPLC方法分离的原理？（包括洗脱液的选择和谁先被洗脱下来等），请chromatography兄详细点。
反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反像是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱，选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。
疏水的填料疏水集团密度只是反相的10%左右,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.
疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具.
8) 求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知道下边该怎么做？望赐教!
这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21表达
你好，我做复性不多，你可以依据有关有多对4对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的，还有用分子伴侣，你可以多看看再尝试：）
至于纯化，如果你的蛋白有游离的巯基，那我觉得很时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知道现在还有没有这个填料，你可以问pHarmacia公司的人。你pM给我，我可以把这个材料发给你，如果没有，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样类似分级沉淀，你就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯化。这样省事点。
9) 我想用一个短肽（5肽）作配基亲和纯化一个可与它特异性结合的蛋白（67kda），用什么填料比较好，您有什么好的见意？谢谢
对于小分子的配基我觉得需要有一定的亲和手臂，否则由于位阻很难有很好的分离效果，说到活化填料的选择我多说几句，大多人都会选择溴化氰，但是这样做的介质一般杂吸附多，此外没有亲和手臂，所以对于小分子的配基有时候纯化效果不好，此外本身对介质也没有交联作用，所以刚性也差，如果经常用极端pH洗脱配基脱落也多，这是它的一些缺点。
环氧活化的琼脂糖凝胶可以有很多的手臂选择，刚性也好，没有非特异吸附，形成的键比别的活化方法更稳定，因此合成的亲和介质性能更出色，你可以选择这样的方法，偶联很简单，你pM你的邮件给我，我可以把一些材料发给你，供你参考。
10) 我目前作的一个蛋白药物的分子量大约是7000， 等电点4，目前要去除内毒素有何简单可行的方法？（此蛋白已经纯化好，但检验内毒素不过关）
你用过分子筛吗？superdexG75对你这种蛋白比较合适。做之前请先用1MNaOH 1ml/min平衡2小时。这种方法除内毒素，非常有效。
如果问题请与我联系。myhok@sina.com，我们以前去除都是用去内毒素亲和的填料直接加到样品中震荡40小时左右,就可以,可以做到<10EU/mg
11) 请问HPLC是在蛋白复性后做比较好，还是在HPLC之后再来复性？？？
复性做得不多,柱上的复性更少,但是就感觉而言还是尽量在柱后复性,因为这样好放大,而且容易操作,对于HPLC的柱子很容易因为沉淀而堵柱子,包括很高的变性剂对机器也不好,也可能因为流速慢而结晶堵住管道等,很复杂,虽然有一些这样的例子,但是我觉得真正操作还是麻烦,何况这样做的量也不大.所以还是选择纯化后复性吧.
12) 我想问问：我把小分子偶连到填料上纯化其兔多抗，用什么结合缓冲液和洗脱缓冲液好？
我现在拟的是：
Binding Buffer:
20mM Tris,1M NaCl,pH 8.0
Elution Buffer:
50mM 柠檬酸，pH 3.0
应该没有问题,如果挂得不好,你可以把Binding Buffer中的1M NaCl去掉,不知道你用什么活化的载体,如果是CNBr,那就得加,但是我们发现有时候盐也可以洗脱下来东西,你试试再说吧.
洗脱你可以用pH 5.0 4.0 3都试试,如果在高一点就可以洗下来,没有必要用太低的,怕对活性有影响
13) 这段在用离子交换柱纯化蛋白，我想问一下，洗脱采用的离子强度的大小范围，应该如何确定，可以根据什么来调整洗脱时的离子强度
一般采用的盐浓度的范围在0-2MNaCl之间，怎么确定得配合你的洗脱的峰的电泳结果来确定，最直接的就是你的目标蛋白，如果在很早就出来，那你洗脱的盐浓度（离子强度）就不用太大，如果出来的很晚或一直没有出来，那就选择更高的盐浓度。
当然你也可以选择用阶段洗脱的方法，这样比较容易放大，分离效果其实也不错，虽然摸索要麻烦点，但是重现性好，也一样可以做得很纯，而且能很精确知道在多少浓度下洗脱出来。我比较喜欢用这种洗脱方法
14) 你好：我有一个困惑了好长时间的问题，想请教。我的蛋白是2KD，在做非还原电泳时，发现除了目的蛋白外，有二聚体和多聚体存在。目的蛋白占44%，余下大部分为二聚体和多聚体。但在做反相HPLC时，只出现两个峰，第一主峰占90%（目的蛋白的位置），出峰时间为13分钟，第二主峰占10%，出峰时间为3分钟。请问在做HPLC时，二聚体和多聚体是否发生改变？用此方法测定含有二聚体和多聚体存在的目的蛋白纯度，是否不妥？我用柱子是C4柱，5υm,300埃。流动相B用0.05%三氟乙酸的乙腈，流动相A用0.05%三氟乙酸的纯水。
我觉得蛋白的聚合应该和存在的环境有很大的关系，但是即使如此，那聚合体在反相上能有这么大的差别吗，你可以用HPLC的凝胶过滤柱子在走一遍试试，或者你把第一个峰和后面的峰都跑电泳看是不是都是蛋白，如果第一个峰也是蛋白，那说明你推断是对的，如果不是，那就是没有分开。
我觉得测定聚合体还是用高效凝胶过滤色谱更好点，非还原电泳也应该不错，反相你可以查查文献有没有这么检测的。
目前检测protein aggregation的方法主要有四种。
1。gel filtration. 根据专门的mark，可以推断大致的聚合物的分子量，不过实际应用上看，影响的因素太多了，结果很不精确。
2。native gel. 大致上可能可以推断聚合的程度，不过结果实在不能让人信服。通常要与其他结果配合说明问题。
3。Dynamic light scattering：简单方便，结果可信，常用于挑选蛋白结晶的条件。但是对于浓度有限制。
4。超高速离心。
文献中多见1，3联用，3 explains the status of protein, and 2 explain the status of concentration-dependent aggregation.
有时也见过1，2联用的，不过仅用于说明次要问题。
15) 请教阁下：我想把一种配基连接到环氧活化的琼脂糖上制备亲合介质，但是这种东西在一定比例的有机溶剂（如二氧六环）和水混合溶液中才溶解，似乎看过文献提到，有机溶剂会影响琼脂糖，不知如何处理这个问题？谢谢。
完全没有问题，因为有些琼脂糖凝胶活化时就在有机溶剂中，所以它们本身不会影响到活化后的琼脂糖的，相反在有机溶剂中环氧基团更不容易开环。所以你不用担心，你的配基稳定的话你可以用0.1MNaOH溶液混合你的有机溶剂室温偶联24小时就可以。
16) 最近我在用sephadexG-75的胶纯化蛋白，总共膨胀了3次新胶（其中第一次是一个批号，后两次是同一个批号），第一次是90度9个小时，加BSA4度过夜，第二次是按照安玛西亚上的时间90度3小时，还放在120度高压锅内灭菌，没有加BSA，第三次同第一次做法，结果发现，第一次的胶一开始的流速很快，根据说明书上给的线性流速可以达到37cm/h，而且分辨率很高，但后来两次，线性流速最快的时候也只有17cm/h，分辨率低得多，不知道是什么原因？？？？（我们用的玻璃管都是一样的型号）
这都很正常的处理应没有问题,但是还放在120度高压锅内灭菌不知道行不行,此外你用什么液体处理的填料呢,pH是在中性吗,在酸性和碱性条件下有可能会使结构破坏的,你可以测定一下.如果pH没有问题,那应该说填料本身没有问题.至于流速你的样品会不会比较粘,你柱压高不高, 如果柱压高,那填料变形压缩,那流速自然慢,而且分离效果不好,你的样品会不会有核酸或多糖,这样会影响的,因此你还是看看柱床体积有没有变化,如果缩小很明显,那你就重新装柱子.
17) 我们用c-18反向柱纯化蛋白，用的流动向是1%三氟乙酸，乙腈，不知道这两种东西，在什么浓度对蛋白有变性作用。
反相一般都是做分析的多,除非你的蛋白很稳定,否则不大适合做纯化,因此在有机溶剂中都有变性的可能,一般10%左右短时间应该没有问题,高了就很难说了,当然这也很蛋白本身关系很大,如果你真的想纯化,那建议还是改C3或C4这样温和点,你的有机溶剂也不需要很高的浓度就可以洗脱,也许会好点,你可以配合你的活性测定找到一个合适的浓度使你的蛋白活性回首率更好,纯化过程一定要快这样也降低变性的可能.
18) 我有一单抗腹水，第一次纯化时，我先用50％硫酸铵沉淀，然后上HiTrap desalting脱盐，再过MonoQ强阴离子交换柱，用IFA检测抗体活性，合并收集峰，最后进行透析。第二次纯化时，是直接将腹水上脱盐柱，没有经过硫酸铵沉淀，结果两次纯化结果，第二次所的蛋白浓度是第一次的三倍多，纯化的抗体我主要是用来做胶体金标记，请问两种纯化过程， 对抗体的纯度会有什么影响，是否会对标记效果产生差别？
腹水中应该有一些脂溶性物质以及一些别的杂质,沉淀后应该更干净点,直接过柱子要注意清洗,至于这两个方法具体效果如何,你可以跑电泳检测,同时也可以做抗体的活性检测,如果没有什么差别,那当然是回收率越高越好. 具体怎么样只有检测后才知道.
19) 用HPLC分析得到的结果对我们用普通的层析柱纯化有什么指导意义吗？
我觉得有意义如凝胶过滤的柱子,那可以知道分子量的分布以及别的信息,而如果是反相可以知道哪个蛋白的疏水性强,用离子交换的柱子可以知道电荷的不同,总之了解的信息越多对纯化越有用,所以说都是有意义的,只是很少有先做HPLC后做纯化的,大多先纯化后用HPLC分析.
20) 离子交换层析，一般用氯化钠洗脱，可以用氯化钙洗脱吗？
没有问题,是盐都可以,只是小心钙离子容易和磷酸盐产生沉淀,你可以用别的缓冲液就没有问题.
21) 我想请问高效凝胶过滤色谱柱那种比较好，用什么流动相，PH 多少为好？目的蛋白是2KD。
别客气，其实高效凝胶柱子一般用TSK系列的最多，你可以看看有没有分离范围窄点的柱子，只怕难有分离范围这么小的凝胶柱。流动相用缓冲液就可以。其实按你的分子量，用反相例如C3或者C4更合适，你也可以直接用C18的试试试，凝胶柱很贵，如果用不了那不是可惜了。
补充一下，由于分子量小，可以用MS来估计disulfide bond是否形成。形成一个，分子量减少2（失去两个proton）。
至于复性，建议在纯化之后进行。有文献证明，蛋白复性，成功的可能随纯度的提高而提高
因为HPLC用的填料一般是5-10um的,而通常用的填料至少也在35um以上,分离效果差别还是很大的,如果要把这么细的填料装在普通的柱子上,压力很大,一般的泵和系统,包括柱子根本承受不了那么大的压力,此外普通的层析系统的泵的精度管道等都很难保证有很高的分离效果,但是你可以把HPLC的条件直接用普通的填料来放大制备,例如你摸好了HPLC的反相或者亲和以及离子交换的填料,如果它们有相应的颗粒大的普通的填料,那就可以直接用HPLC上的条件,这样只要你HPLC的条件很好,那就可以,但是高效凝胶过滤色谱难在普通的柱子上放大,它也没有相应的填料.
22) 你所提及的样品如含有核酸或多糖会影响sephadexG-75柱的流速及分辨率,具体何解？
我觉得是这样的：凝胶过滤的原理是小分子能进入的孔到多于大分子的，但是如果有多糖或核酸的干扰（很粘），这样一些小分子也不能进入更多的孔（和没有干扰的相比），这样自然分离效果不如没有干扰的。这是其一。
其二是由于这些东西粘度大，那么同样流速下，由于sephadexG-75压力比平常的大，所以胶会压缩变形，这样它的内孔和没有干扰的排阻极限也不同，所以分离效果自然比没有干扰要差。特别是压缩会使孔变得不均匀。
当然相对而言，前面的原因是最主要的，后面是次要的。
其实不仅是凝胶过滤，别的色谱有这两物质（还有一些脂溶性的物质）也会一样干扰传质，因此影响分离效果。所以这两个东西一般要小心，同时它还会降低柱子的寿命。
23) 我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．我想试用硫酸铵分级沉淀除去部分杂蛋白，再过s-100.但不知硫酸铵分级沉淀该如何具体操作？
你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱，此外其实你的蛋白分子量很小，杂质应该大多分子量比它大，你直接过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来，或者上superdex 30 大于10KD的先出来，而你要的在后面，然后你再用离子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质没有前面说的那两种好，此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和蛋白一起出来的，你测定样品的电导看看。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，你可以设计你的实验，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
24) 如果怀疑是多糖造成的黏度过大，请问应该如何去处多糖？
多糖去除你可以用硫酸铵分级沉淀,也可以用低温乙醇分级沉淀.一般的多糖也不带电荷,你可以用离子交换挂住你的蛋白,这样也是可以的
25) 问一个有关DEAE Sephadex A 50的问题，我的填料处理好后别人拿去用了，用了一次，结果我把他放到烧杯后，发觉已成絮状，不知有没有坏掉？可以再用吗？用什么方法可以把它恢复到原状？
这个絮状的东西有颜色吗，会不会是染菌了，或者是脏的东西没有处理干净，你可以用0.5MNaoH泡半小时，沉淀后倾去上清，做三次这样的处理，如果还有不干净的东西，你可以用6M盐酸胍泡半个小时，然后处理和NaoH一样，再换水，这样你看能不能洗回来，如果不能很好沉淀下来，那就不能用了。凝胶类的填料很容易长菌，用完得洗干净，保存在20%的乙醇中。
26) 我想在想纯化peg修饰的蛋白，可是我目前只有弱阳离子交换的羧甲基纤维素，你看能不能纯化阿，好像文献上都用sp-sepharose，纤维素是不是不行啊？另外，目前没有专门的层析装置和蠕动泵，我用普通的层析柱是不是就可以阿，流量是不是也不用太精确阿？谢谢！
离子交换的方法是可以的，但是我觉得疏水也很值得一做，因为修饰后电荷变化了，其实疏水性也增加了，所以这些方法都可以，此外只要你的CM纤维素能挂住就可以分离，，SP-sepharose只是更强点，而且流速更好点，你先试试，不行再换吧。没有蠕动泵纤维素流速会比较慢吧，流量肯定不精确，我觉得还是有个泵好点，没有检测器也不行，这些是纯化的基础，要不可是比较麻烦的，怕实验难重复。何况你没有泵也没有办法做线性剃度洗脱。反正是太简单点。
27) 问一个有关DEAE Sephadex A 50的问题，我的填料处理好后别人拿去用了，用了一次，结果我把他放到烧杯后，发觉已成絮状，不知有没有坏掉？可以再用吗？用什么方法可以把它恢复到原状？
这个絮状的东西有颜色吗，会不会是染菌了，或者是脏的东西没有处理干净，你可以用0.5MNaoH泡半小时，沉淀后倾去上清，做三次这样的处理，如果还有不干净的东西，你可以用6M盐酸胍泡半个小时，然后处理和NaoH一样，再换水，这样你看能不能洗回来，如果不能很好沉淀下来，那就不能用了。凝胶类的填料很容易长菌，用完得洗干净，保存在20%的乙醇中。
28) 首先我想问一下agarose和sepharose区别,我的理解是:都指琼脂糖,但agarose是未连接其他介质的,而sepharose是连接其他介质的,不知理解对不对?请指教!Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是一种东西吗?
其次,我想问一下你纯化过GST融合蛋白没有?我现纯化一个融合蛋白(某种酶和GST融合),我买了SIGMA公司的GLUTATHIONE-AGAROSE五毫升,但我不知怎么做.分子克隆说直接将亲和介质于细菌裂解液混允离心....我不知我买的可不可以这样做.而产品说明书上说做柱子,我就想1毫升的柱子怎么做,装介质的柱子的高度和直径有要求吗?
agarose是通常的琼脂糖的英文名称，大家都这么叫，它不是商品的注册名称。而sepharose是amersham的琼脂糖凝胶的注册商品名称。所以你理解是有偏差的，此外agarose不一定是琼脂糖凝胶，而Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是同一类东西，只是厂家不同。
GST融合蛋白纯化过，5ml的凝胶你可以装在1.6x20的柱子上用，也可以按照分子克隆的做法做，取决于你的喜好和方便。1ml不好装，除非有专门的小柱子，对于直径和高度没有特别的要求，我们的做法是：
1、 GST琼脂糖凝胶FF装柱，0.7X2.5cm，柱床体积为1ml；
2、 用缓冲液1平衡5个床体积，流速为1ml/min；
3、 将10ml发酵液用缓冲液1稀释到20ml，0.45μm滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；
4、 用缓冲液1再洗10个床体积，流速为1ml/min；
5、 用缓冲液2洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰
6、 用纯水洗5个柱床体积，再用20%的乙醇洗5个柱床体积，流速为1ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存
缓冲液组成：
缓冲液1：20 mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2 M NaH2PO4 19ml，0.2 M Na2HPO4 81ml加水至1000ml。
缓冲液2：50mM Tris-盐酸缓冲液，pH8.0，配制：0.1M Tris 50ml，0.1 M 盐酸29.2ml，307mg还原型谷胱甘肽，加水至1000ml。
29) 请问con A sepharose 4B 亲和凝胶使用前的处理方法？
不需要特别处理，直接平衡后就可以上样了。
30) 谢谢，我想问一下，是不是离子交换必须要线形梯度洗脱比较好呢？还是阶段洗脱好？检测器我想先收集然后再去测紫外。
也不是,有的时候阶段洗脱效果就很好,而且容易放大,不需要仪器,我比较喜欢,效果差不多,但是很省事.但是关键是容易重复.紫外分管测定那也可以,我上学也那样做过.
31) 我要从总蛋白中提出250KD的NF1蛋白做western，由于量少所以要做免疫沉淀。我是利用小鼠来源的NF1单抗与兔抗小鼠IgG、protein A－sepharose来做免疫沉淀，发现做完后跑电泳，出现了两条带，分别位于85KD、55KD左右，请问这会是什么东西？会是抗体吗？还有没有可能是目标蛋白变小了？
抱歉,我没有做过免疫沉淀,但是抗体做过一些,抗体重链没有大到85KD的地步,所以应该不是抗体.会不会你的蛋白有四个部分构成,分别是两个85KD和55KD,这样分子量正好和你的250KD相当,你可以跑非还原电泳看看,是不是还这样呢.如果不是,那说明是由这两个部分组成的.都是由二硫键连接的.
32) 我提胰蛋白酶，主要参考用张龙翔书里的办法，先提卵类粘蛋白，首先过SEPHADEX G-25 柱子脱盐，然后过DEAE纤维素离子交换柱；第二步是用卵类粘蛋白合成SEPHAROSE-4B亲和柱。这些层析过程都可以在缓冲液里面加0.02%的叠氮化钠抑菌吗？以后怎样去除？
我提胰蛋白酶粗酶用的乙醇，可以用异丙醇或正丁醇或其它的低分子醇吗？浓度多大为好？
那实验我知道，你用什么方法活化琼脂糖呢，胰蛋酶的亲和纯化方法很多，配基有大豆胰蛋白酶抑制剂，抑肽酶，苯甲脒类，特别是后面的苯甲脒，可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶，何必自己去提取呢，感觉比较复杂，自己偶联这些配基也可以，层析过程不需要加0.02%的叠氮化钠抑菌，尽量不要加，那透析或者除盐柱子都可以，或者直接上一样的亲和柱子，用不含这个的缓冲液洗，最后洗脱下来就可以了。
最好还是用乙醇，浓度很难说，因为和你的蛋白浓度有关，别的醇用得很少。此外你可以考虑用硫酸铵沉淀，这样对活性更好些。纯化也可以用疏水，因为它在苯基琼脂糖凝胶柱子上能被吸附，配合硫酸铵沉淀也是不错的选择。
33) 楼主,我想问一下phenyl-sepharose CL-4B有没有浓缩作用,以前有人做过,克也在纯化时,浓缩5-10倍,可是,我却没有使纯化的蛋白浓缩,我想得到浓度较高的蛋白,又想省去浓缩这步,楼主能不能指点我一下,缓冲液的流速以及柱子的选择上有什么要求,使洗脱下来的蛋白浓度会较高,
亲和，疏水，离子交换都可以浓缩样品，但是离子交换是最便宜的，苯基可以浓缩，但是想有好的浓缩效果，最好用一次洗脱或者阶段洗脱的方法，我建议你先用离子交换柱子挂住，然后直接用高盐洗脱，因为不知道你蛋白的等电点，所以不知道你该选什么柱子。如果样品含盐高，那可以用疏水，然后直接用缓冲液洗脱就可以。亲和也差不多这样的。流速没有太大的要求，柱子看你手头有什么，离子交换是最常用的。上点样
34) 我做的是青霉素酰化酶,样品盐浓度很高,我是两步纯化,第一步使用氧化铝物理吸附,使用含有1.7mol/L(即200g/L)硫酸铵的ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗脱的.第二步想用phenyl-sepharose CL-4B脱盐和浓缩,可是效果很差,基本是起不到浓缩的作用.
我做了好几次,都是这样,可是前面有人做的时候起到浓缩的作用,我现在却做不出来,也联系不上以前做过的人.
phenyl-sepharose CL-4B使疏水层析,我现在就这种柱子,我想问的是装填料的时候用的玻璃柱株高和直径的比值大的还是小的,洗脱蛋白时会使洗脱的蛋白峰值高一些,谢谢
这个酶纯化应该可以用亲和的方法做吧,其实只要把青霉素G偶联到琼脂糖凝胶上就可以特异用于这个酶的纯化.苯基琼脂糖凝胶浓缩可以,但是除盐不好,你想浓缩效果好,你可以把硫酸铵的浓度提高到2.5M再挂在柱子上,直接用ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗就应该可以.你想浓缩的效果好,那尽量用短粗柱子,也就是径高比大的柱子.这样扩散少些.此外要用高载量的填料,颗粒细点,起始盐浓度高点,这样保证能浓缩好你的样品.
35) 楼主：这段在用离子交换柱过抗体，请问抗体的吸收图谱是怎样的？它的特征吸收峰在哪里，不同的多克隆抗体是不是还有自己的特征吸收峰，
抱歉,你是说色谱图还是紫外吸收图呢,蛋白一般都是在280检测的呀,不同的的蛋白虽然有一点差别,但是那也不是很明显的,其实就用280就可以了.
36) 我的蛋白以GST融合蛋白的形式表达在E Coli中，分子量14~15kDa，蛋白的疏水性很强，等电点在7左右。菌破碎后，用表面活性剂提取的融合蛋白，据文献说是由于此蛋白和细胞膜结合，所以如果不加表面活性剂，上清中电泳检测不到。加表面活性剂后，提取效率还可以。上GST 胶。开始时采用先洗脱融合蛋白，再酶切，洗脱采用10mM GSH洗脱，没有加表面活性剂。然后酶切后，就会产生大量沉淀，上清中没有目的蛋白。后来在酶切buffer中也加表面活性剂，就得到了改善，没有再出现沉淀，目的蛋白也存在于上清中。目的蛋白中仅有一个cys。
我的问题是：
1、老板不知从那看了篇文献，是专门讲此蛋白的结构的。不过人家的蛋白是合成出来的，然后用反相C18（300A孔径）分离的。他非要我不上GST胶（因为binding 效率不是很高，GST价格很贵，工业化好像也没几家），提取液先酶切，沉淀后离心上反相分离。我觉得沉淀中的杂质组成不很清楚，如果有大一点的蛋白变性沉淀之类，用反相会不会很容易堵柱子？我看一些资料，反相只用来分离或分析短肽，较少用于分离较大的蛋白，尤其是我的杂质都不清楚的情况下。
2、过去曾做过superdex200 10/300分离酶切产物时，由于目的蛋白聚集，我也没有marker，每个峰较难定性，电泳看不出来，可能是浓度太低。我想用反相有没有可能建立一种便捷的分析方法来分析纯化过程中目的蛋白的量？
3、我的蛋白酶什么好的测活方法，只能做细胞毒性试验。有一篇文献说在生理条件下，我的蛋白没有二级结构，尽管在一定浓度下未沉淀，但是都以多聚体存在，如果加入50% TFE(三氟乙醇，trifluorethanol),则可使其在中性pH下恢复二级结构，此时大部分以二聚体存在。那么，你用过TFE防止聚集么？这样做有什么根据么？好象一般都只用表面活性剂（对细胞有毒性），或L-arg，PEG之类的，可我没找到在L-arg和PEG存在下，目的蛋白的结构功能方面的文献。现在不清楚多聚体是否就一定没有活性？郁闷阿，望多多指教！
4、我的GST结合效率不很高，总有部分流穿（应该没有超过载量），而放慢流速改观也不明显，后来结合的时候binding buffer中也加表面活性剂稍微好一点，但还是不满意。我曾试过把流穿收集再进GST柱，可是几乎不结合，所以我怀疑GST部分可能有变性和不变性两部分。我曾看过一文章，提取时采用离子型表面活性剂，binding时在加入triton X-100，采用混合表面活性剂，据说可以使GST部分复性，增加binding，我还没有试过。
您有这方面的经验么？多谢了
1,其实反相价格会更好点,因为有机器,柱子和流动相也不便宜,其实我们用的是国产的GST融合蛋白的纯化系统,价格就不贵,你PM你的邮件给我,我给你一份材料,反相柱子其实做不了多少东西,所以建议你别用它制备.
2.只要你有标准蛋白,那用HPLC做分析代替电泳是很不错的,因为这样时间缩短了,效率更高,而且定量很准确.
3.三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(环境极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.
4.至于你柱子挂得少,那有可能是因为有些目标蛋白的结构和能挂上的不一样,那你可以试试降低上样的浓度,包括降低疏水性,加表面活性剂看看,这个不做怕是不知道的,因为只要GST没有活性或被屏蔽,那肯定挂不上.
37) 色谱兄能否推荐几种不错的离子交换介质呢？我现在知道有羧甲基纤维素，sp-sepharose等，但是砝码西亚的sp-sepharose太贵了，450/25ml。你能推荐一下比较不错的介质吗？物美价廉的，谢谢！
维素不好操作,还是用琼脂糖的吧.我用的是国产的.你可PM你的邮件给我.我给你相关的材料.
38) 一是电泳后凝胶里面德蛋白质有什么可靠的方法回收？
二是我现在有个GST融合蛋白，用thrombin酶切后的目的蛋白条带很弱，请问可能是什么原因有什么办法解决
还真没有做过,你可以用电洗脱的方法,然后浓缩可以用离子交换不就行了或者透析袋加PEG8000浓缩,只怕这样会变性了.
你酶切带弱,那可以尝试增加酶的量,或延长酶切时间,.此外看有pH有没有问题,你的蛋白浓度是不是太低.
39) 我所说的大颗粒是指蛋白或病毒颗粒。这些颗粒的直径会大于填料的孔径。谢谢！
完全没有问题,我用琼脂糖凝胶6B给病毒除过盐,也纯化过,这样可以把很多小分子的蛋白去除,再过离子交换就可以比较纯了病毒.病毒都可以,那大分子的蛋白也没有问题,包括质粒也可以用凝胶过滤纯化.
40) 谢谢chromatography的答复。介质有现成的，但很贵啊。我要分离谷胱甘肽还原酶，文献都是用2',5'-ADP－Sepharose 4B纯化，以后你多留意点，
别客气,我的意思是你用兰色琼脂糖凝胶试试,此外有谷胱甘肽琼脂糖,应该也可以用来纯化谷胱甘肽还原酶吧,或者专门合成一个类似底物的也可以,其实你完全可以自己合成填料的.也许这样能很好地解决你纯化的问题.
41) 我用环氧氯丙烷活化琼脂糖，到哪儿可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶？GOOGLE 搜不到。我们没冷室，层析过程加什么来抑菌？我将层析柱放冰箱里层析以防长菌和防酶降解，可以吗？
环氧活化的琼脂糖凝胶你要偶联什么配基呢，我有国产甲脒琼脂糖凝胶的材料，你pM你的邮件，我把材料发给你，层析过程水是流动的，所以不会长菌，不需要抑菌，层析柱灌满20%的乙醇，放在冰箱4度中保存很久都没有问题。
42) 查尔酮合成酶的酶活要用同位素方法测定，而我的条件没办法测所以需要送到别的地方测。这会造成很大的麻烦，请问chromatography 有没有人做过的，有没有好的方法可以借鉴？另外一个问题是：利用分离纯化这个蛋白的填料中有没有亲和偶联剂？我一直都没有查到过。
这个酶应该和查尔酮以及苯基酮都有特异的亲和力,你完全可以自己合成一些亲和填料,我们用的是国产活化好的琼脂糖凝胶合成不少亲和介质,效果不错,我觉得你可以用亲和的办法,即使是苯基琼脂糖凝胶也可以纯化这个蛋白.因为它和芳香环有很特异亲和力.
你说的亲和偶联剂是配基还是活化的填料呢.
43) 请问，如果所提蛋白质浓度低，如何进行浓缩或纯化。我试过丙酮沉淀法，但沉淀很难溶解，没法往下作了。有没有更好的方法？谢谢！
那你直接把你的样品放在透析袋中，然后在外面用PEG8000粉末浓缩，这样就好了，你也可以超滤浓缩。丙酮沉淀要在低温搅拌情况下缓慢加冷丙酮，避免局部浓度过高，此外沉淀后马上离心，这样也可以避免变性而不溶解。
44) 三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(环境极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.
关于TFE对于a-helix的形成，现在有两种观点。
1。TFE能稳定a-helix的形成，及这个蛋白本来就是a-helix的结构，但是由于dynamic太严重了，或其他的因素，造成表观上看不见。加入TFE能够稳定之，使之表观可见，用CD啊什么可以看得到。
2。TFE能使蛋白变成a-helix。及这个蛋白本来不是a-helix的，但是由于加入TFE的作用，使之变成a-helix。
具体的原理我就没仔细读了，不过这两方都有一定的文献证明，现在还不知道谁对！ ^_^
45) 我是需要在兔肝中纯化一种酶,而且我是刚刚接触蛋白纯化我有几个问题想请教:
1 : 我的目的蛋白在强阴离子柱上结合(buffer : 25 mM 磷酸盐 PH 7.4),但是似乎结合力很弱(因为上样时就有少量蛋白flowthrough,而且洗脱峰在电导值刚开始升高时就开始出现了),我换用了20mM Tris PH 8.2 buffer 之后,蛋白的结合力好像还是很弱,洗脱峰没多大改变.请问我用 PH 8.5 Tris buffer 会改善我的问题么?
2: 由于目的蛋白丰度低易失活,而且实验室浓缩的条件有限,我过了脱盐柱和粒子柱后样品蛋白含量低体积大,我想请教:我接下来大体积上疏水柱能行么?会很大的影响我的分辨率么?我的蛋白在疏水柱上结合力很强,总是到梯度最末才洗出来,我该怎样优化一下?
3:我有亲和胶(red A) ,但是由于经济上的原因不能用特异的含配体的溶液洗脱,只好用高盐的洗脱液(含2M KCl),这样是不是分离效果很差?值得我去用梯度洗脱么?(因为我没有空柱,上不了机器,只能用手工做,这样做梯度很是麻烦)
4:天然的肝脏匀浆梯度离心后,在PH 7.4 的磷酸盐平衡液下,为什么绝大部分(95%以上)蛋白都结合不上去呢?我最好要把PH值降到多少去试?6.8合适么?
谢谢你的指导!!
1.你可以用5-10mM缓冲液上柱子,同时pH调为8.5,这样可能会好些,此外如果还是很弱,那你可以用Q柱试试.提高pH应该有用,但是有的蛋白吸附力弱,所以盐一高挂不住,因此要降低到5-10mM也许能更好点.
2.大体积直接上疏水没有问题,既然你的目标蛋白是最后出来,那你可以用0.5-1M盐洗去杂质,然后用0.1M洗脱,根本不需要走梯度,这样快,分离效果也不差,而且这样洗脱的体积小,容易放大.
3.你说的Red A 是procion red HE-3B吗,是染料亲和吗,既然这个填料可以,那么蓝色琼脂糖凝胶也可以,它们都属于染料亲和,这个应该更便宜点,洗脱用盐没有关系,不需要竞争洗脱,何况那样染料很难去干净.手工洗脱,你可以用阶段洗脱的方法,如你用0.5,1,1.5,2M的盐阶段洗脱就可以,不需要走梯度,只要你多摸索,你会找到个合适的浓度,效果一样很好,没有问题.
4.挂不上你是指的亲和还是离子交换呢,我想如果是亲和,那你可以降低pH,同时还一个缓冲体系,我觉得主要在pH,你降低到4-5那挂得就比较好一些吧.
46) 1.我正是用的Q柱出现的上述问题,
2. red A 确实是一种染料亲和,
3.我说的挂不上是在souce 30 S 和streamline sp上样的体积
4.你用akta的设备么?我用purifier 100 ,发现电导值总是稍迟于开始的梯度.
1,那你按我提议试试吧,降低缓冲液浓度,提高pH值.
2.那它的结构和我说的那个染料是一样的吗,你也可以试试蓝色琼脂糖凝胶,都是颜料,结构也相似.
3,挂不上那也可能,不知道你挂的是用什么条件,这个酶等电点是多少呢.
4.AKTA就是那样的,因为梯度是从一开始就算,而电导至少要近一个柱床体积才有变化,所以稍迟.
47) 你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱，此外其实你的蛋白分子量很小，杂质应该大多分子量比它大，你直接过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来，或者上superdex 30 大于10KD的先出来，而你要的在后面，然后你再用离子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质没有前面说的那两种好，此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和蛋白一起出来的，你测定样品的电导看看。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，你可以设计你的实验，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的目的蛋白仍挂不上 SP柱（我是一个新手，正在做蛋白纯化．我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．），是不是理论IP与实际有相差？
48) 有可能还在柱子上,如果你所有的组分都检测了没有活性,那这样的可能性很大,你可以用0.5,1M的NaCl分别洗脱,再测定这两个洗脱组分的活性看看.你的酶稳定吗.
我的酶还算比较稳定，４C下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变，－２０C时间就更长了。
49) 问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，很多人都这样说，所以科室里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。
50) 多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的目的蛋白仍挂不上 SP柱（我是一个新手，正在做蛋白纯化．我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．），是不是理论IP与实际有相差?
理论上的和实际是有差别，但是不会这么大，你的样品中盐的含量高不高呢，有盐也会挂不住的。
51) 我的酶还算比较稳定，４C下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变，－２０C时间就更长了。
我分别用了０．５Ｍ，１Ｍ的NaCl洗柱子，测蛋白浓度还是很低，中间有几个管浓度较高，然后测酶活却发现活性依然很低，上柱前测的还有４４１IU／１０ｕｌ，而收集管里的顶多只有２０IU／５０ｕｌ。
所以，我很怀疑它到底挂在柱子上没有，于是我检测了一下上柱后用初始缓冲液洗脱下来的收集液，发现酶活居然有１００IU／５０ｕｌ，我想是不是初始缓冲液的离子强度就太高了呢，０．０１１Ｍ柠檬酸－氢氧化钠，PH５．５？然后就用的是手工步进式洗脱，０．０５Ｍ，０．１Ｍ，０．１５Ｍ，０．２Ｍ，０．２５ＭNaCl，直到后来的０．５Ｍ，１Ｍ．
另外，我还想请教您：
阳离子层析柱用完后如何保存？先用１M氢氧化钠溶液，然后再用含硫柳汞的缓冲液，行吗？可不可以用其他的防腐剂呢？如有，可否推荐一下？硫柳汞我这里包装大，２５ｇ，又不能分装，需要避光保存，先谢谢了！
那用更高点的盐洗脱看看，例如2M，如果还是没有下来，那也许是沉淀在柱子上了，可是如果吸附，你的穿透应该活性很小才是，可是穿透好象有不少，是不是没有挂住呢。
保存你用20%的乙醇过柱子就可以，然后在低温4-8度就可以，没有必要用硫柳汞。
52) 问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，很多人都这样说，所以科室里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。
纯化和表达系统有一些关系，但是最重要的还是看蛋白的特性，所以不一定真核就不好纯化，所以我觉得不用担心。纯化的方法你可以用离子交换等纯化方法，具体很难说，得看你的目标蛋白而定。
53) 你好,我想请教一下,我现在在做包涵体蛋白的柱上复性和纯化,是上的疏水柱.疏水上柱要求硫酸铵的浓度在1.75M以上,但是高浓度的硫酸铵在6M的盐酸胍中不能溶解,不知道你是否碰到过这类问题.而且我的蛋白又不能用8M的尿素溶解.缓冲液现在用的是50mM的磷酸二氢钠,PH7.5.还想请教一下,上样的浓度有要求么?不知道你有什么好的建议呢,谢谢.
要复性你的蛋白浓度就不能高，这样你溶解你的目标蛋白也就不需要那么高的盐酸胍了，这样你就可以把盐浓度提高点。上样浓度应该小于0.1mg/ml，具体情况得看你的蛋白，我建议你可以用简单点的稀释复性或者透析试试，如果不是特别复杂的复性最好能用简单的方法，别过柱子。
54) 不好意思，什么叫穿透啊？不懂唉，请指教。
另外，我还想问一下“交换纤维素解离基团的pK值”？，“用阴离子交换纤维素时要选用低于pK值的缓冲液，用阳离子交换纤维素时要选用高于pK值的缓冲液。”是什么意思，谢谢！
所谓穿透就是上样后用及平衡缓冲液洗下来没有被吸附的部分叫穿透,pK值用于表示酸碱性的强弱,阴离子交换的填料是碱性的,所以你需要用用缓冲液pH小于pK值这样它才能带正电荷,用于交换带负电荷的样品,否则就挂不上样品.而阳离子是需要缓冲液pH高于pK值,这样它才能解离带负电荷,用于吸附带正电荷的样品.否则也挂不住.
55) 我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带，特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您有什么高见，谢谢。
这样纯化的蛋白可以免疫动物,没有问题
56) 向您请教一个问题，我用pET28载体、宿主菌BL21(DE3)表达目的蛋白，目的蛋白的两端都带His-tag,蛋白的大小为37kD，在利用Ni-NTA纯化时总是在目的蛋白带旁边伴随一条带去除不了，请问有什么高招可以解决这个问题？!!!此外，该表达产物为包涵体，请问这种产物可不可以直接用来制备抗体？谢谢！！！
也许这两个都是你要的目标蛋白呢,会不会是这样呢,你可以用his的抗体做WB看看是不是这样的,如果是,那说明是这样的情况.此外你可以再平衡缓冲液中加0.5%的吐温等表面活性剂,这样可以去除一些非特异吸附,此外你可以用pH45左右的变性溶液去洗,这样也能去掉一些杂质,最后在用咪唑溶液洗脱.如果你这样都去不掉,而做WB也有两条带,那说明可能是降解,超声破碎的时候功率别太大,时间也别太长,注意温度,因为超声有时候也可能会使蛋白降解.
57) 我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带，特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您有什么高见，谢谢。
你可以在你的平衡缓冲液里加一些盐,0.2-0.5MNaCl,这样可以降低一些因为离子作用带来的非特异吸附.同时在平衡液里加0.5%吐温等表面活性剂,这样是不是有点改善,此外你也可以用阶段洗脱的方法,例如用5mM和10mM还原谷胱甘肽去分别去洗脱,这样看看有没有什么区别.此外还要注意的问题是超声破碎时注意功率和时间.避免过强时间过长,降解蛋白.
此外你可以GST抗体做WB看是不两个都是你要的东西，会不会是降解或造成这样的结果。你可以加点酶的抑制剂，此外抱歉我不是主任，嘿嘿。
58) 我准备用30％－60％硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？
30％－60％硫酸铵沉淀可能对你的目的蛋白来讲，太粗略了，如你所言，目的蛋白可能在沉淀中，可否分级沉淀，３０％－５０％，５０％－６０％，再测一下活性可能就分开了，20mg/ml的蛋白浓度对于层析是有点高，洗脱液浓度变化或PH的改变都会使蛋白有损失，最好不要超过１０mg/ml。
59) 我的蛋白是用pGEX-4T载体在BL21中表达的，表达量很高，形成包涵体，为了获得可溶性蛋白，我现在尝试用较低浓度的诱导剂诱导，此前用不同浓度诱导做过对比，电泳后表达量的差异不大；但当我再降低温度诱导后发现，超声处理后的上清液中目的蛋白条带很微弱，大部分目的蛋白还是在沉淀中；这和我降低诱导剂前做的不一样（同温度），为什么目的蛋白的可溶表达会不稳定呢？对同一菌种应该是固定的吧？我很迷惑．
另外，请问，一般情况下２８度，３０度诱导时间应该分别多少才合适？我们的光度计出了点问题，无法测定ＯＤ值．谢谢．
还有，你有没有较好的蛋白纯化的文献介绍几篇，好吗？
60) chromatography 兄，请教一个问题:
选择填料的时候，CM和SP怎么选择？什么时候选择弱阳？什么时候选择强阳？
再问一个：
我们实验室有两种蛋白，一种等电点5左右，另一种等电点9左右，为什么都可以用CM阳离子交换纯化？（用的缓冲液都呈中性）
等电点5的那个我觉得选择阴离子交换柱好些，为什么不这样？
没有什么特别的原则，重要是纯化的效果好就可以，一般都是先选择弱的．
纯化是把目标蛋白和杂质分开就可以，所以其实在这样的情况下，酸性蛋白是挂在阴离子柱上，而后面的挂不住，但是只要能把它们和杂质分开就可以．所以酸性蛋白流穿，杂质被吸附也可以，所以不一定非要吸附也可以．
61) 我准备用30％－60％硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？
也不是，其实沉淀你可以做仔细点，例如先用３０％沉淀，取上清，再把上清加到４０％，然后如此类推，一直到６０％，然后测定沉淀和最后上清的活性，这样就知道哪样的浓度沉淀效果比较好，既然你的活性都在沉淀里，那直接溶解在一定浓度的盐中，直接过滤上柱子就可以，浓度高也没有关系．
62) 急问：我的样品蛋白液本来放在４C保存，谁知有人把温度调到了１８C已有一天，请问这样对蛋白会有多大影响？我纯化的是一种酶。另外，树脂在这样的温度下性质会有所改变吗？某人说４C－３０C的情况下，树脂不会有太大改变。是这样么？谢谢！
不知道你的蛋白稳定不稳定，你可以测定一下活性看看，如果没有什么变化，那就没有关系，树脂不会因为温度有什么变化的，尤其是你的树脂不是以蛋白为配基的亲和填料．，没错在４C－３０C的情况下是没有多少改变，但是那也看多长时间，什么树脂，因为时间长会长菌如果不加抑菌措施的话．
63) 我用鼎国的sepharose 4-B 合成亲和柱可以吗？
是活化好的吗，还是普通的琼脂糖，他们的填料颗粒有的比较粗，不知道你选择的粒径是多少范围的，最好要细一些，４５－１６５um比较好，用一般应该没有问题．
64) 比如说，sephadex G-25的分级范围是1000～5000，我想问一下，分子量小于1000的分子（例如盐）是怎么样通过的？它是从凝胶内部通过吗？不是说只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过吗？
凝胶的中间有的是大小不同的孔,盐自然在这些孔中间通过,而所谓的分离范围也只是说在这样的分子范围内有差别,离开这个范围就没有分离效果,所以小的和大的都没有什么分离效果,因此不是只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过.而是在这个范围的分子有分离效果.
65) 请教：要从发酵液中纯化出一个分子量约为1100的具有抗菌活性7肽，前期的提取采用的是酸沉醇提的方法，粗提物中蛋白含量39mg/ml。资料上说，纯化这个小肽要用sephadexLH-20，可是我没有。：（尝试用sephadax G15 进行了纯化，出现了五个没有分开的峰，第六个峰分的还算可以。考虑到可能是粗提物中的组分太多，于是对粗提物用sephadex G200进行了纯化，得到一个单一峰，收集后，冷冻干燥，再过sephadex G50，得到两个吸收峰，可是实验发现，这两个吸收峰没有抑菌活性了：（洗脱液用的是pH7.0的PBS，检测波长280nm。请问可能出现的问题有哪些？洗脱液选择的有问题？检测波长有问题？｛我的这种多肽，资料上说HPLC的检测波长为210nm,也有205nm的。｝
你的问题很不明确,用sephadexLH-20纯化除了有一部分凝胶过滤外,还有一些分配色谱的作用,所以这个介质和sephadax G15 是不太一样的,你纯化出多少峰都应该进行抑菌实验,否则很难知道你要的组分在哪里.既然这个分子量这么小,那你上sephadex G200,估计你的目标多肽在最后面,所以你得到的那个峰不一定有你要的东西,而在后面,我是这样猜测的,关键你要测定活性,所以你再纯化也没有活性,问题在于你没有时时做活性检测,填料选择不很正确,检测波长我不清楚对不对,关键你要选择合适的柱子,同时每一步都做活性检测.
我确实是对每个峰都作了抑菌实验,Sephadex G15的每个峰都有抑菌活性.粗提物上G200只得到了一个吸收峰,要是我要的组分在后面,可它连个小峰都没有呀.。此外，有人建议我，先使用硅胶柱对粗提物进行处理，请问可供选择的柱子有哪些？谢谢。
那你没有说明G200的峰是不是有活性，你也可以考虑硅胶填料，那得选择c8或者c4的反相硅胶的柱子，可以做HPLC，这样也是不错的选择，毕竟通常的凝胶柱子很难有很好的分离效果。
66) 如果我用sephadex G-25脱盐，如何选择缓冲液？因为我认为，如果选择含盐的缓冲液，本身带入了盐，能起到脱盐的效果吗？如果选择含盐的缓冲液，
缓冲液里含有的盐会最后流出来吗？ 另外，分子筛有没有载量的问题？
缓冲液选择看你需要什么缓冲液就选择什么,没有什么特别的要求.你的缓冲液当然是没有盐的,否则那何必除盐呢.含盐缓冲液当然不能去掉盐了,它只能把你样品中的盐去除,用的原理是蛋白在柱子中走得比盐要快,所以先出来.如果你缓冲液中有盐那虽然盐有后出的原理,但是因为你一直用含盐的缓冲液去冲柱子,所以它的盐是去不掉的,这和样品中的盐是不一样的.
分子筛其实也有载量的问题,但是关键还是看上样的体积,例如分离上样体积不能大于10%柱床体积,脱盐不能大于30%,具体的数和样品有很大关系.
67) 既然这样，我想完全脱盐时，洗脱液可以选择水吗？因为缓冲液中的缓冲对总会有盐的存在，对不对？
是的,只要你的样品在水中溶解得很好,而且很稳定,那选择水就可以.
68) 请教色谱兄，我现在用纤维素分离纯化蛋白和peg-蛋白，跑完我用page检测了一下，没有完全分开，有一些是一起流出来的，我想知道为什么分离效果不好？我该如何调整阿？加长柱子可行吗？还是要更换介质阿？我用的梯度洗脱。多谢拉！
peg-蛋白要想完全分开是比较困难的,因为PEG修饰的程度不一样,所很难完全分开,不过纤维素分离的效果是要差点,你可以通过延长柱子,降低流速,延长梯度的办法来提高分辨率,不行你可以换琼脂糖系列的,但是我觉得你也可以考虑疏水,这两个方法都可以.此外洗脱你也可以用不同盐浓度阶段洗脱,这样有时候分离效果也不比梯度的差.
69) 非常感谢色谱兄，琼脂糖的比纤维素的好很多吗？另外，上次你给我了份材料没有价格，能否给份有价格的材料，这样也好和老板谈谈，因为老板控制的挺严，谢谢！！flyhyx@yahoo.com
有的，到时候发给你吧。琼脂糖肯定比纤维素分离效果要好，载量也大，还有就是柱床体积不会变化，流速高。
70) 想请较：质粒纯化中超螺旋和线性的如何实现有效分离（制备规模），且不使用plasmidselect之类亲和介质。
亲和是最有效的方法，我们有现成的工艺，包括去内毒素，你可以把你的邮件pM给我，我给你发一份相关的材料，你可以看看。
71) 我所纯化的蛋白质大概是66kDalton，进行的亲和纯化。现在出现几个问题想请教：
1。用的Ni-NTA进行亲和纯化，以前一直是在250mM咪唑中洗下目标带，现在50mM就有，是不是我的镍柱不太好使。
2。因为亲和纯化后我的蛋白在最上面，所以我现在用sephadex G－100，但是我发现效果很差，不仅回收率低，而且也只有小分子量的杂带能去掉。因为在我的目标带下面不久就有一个小的杂带，而且我想把我的蛋白去结晶，那样要求的纯度就很高。这样的话是不是选用的纯化材料不对，而且对于流速和柱子长度要求就很严格了。
有可能你的载量下降了，所以才那样，你需要清洗了。
我觉得你最好选择新的填料，其实你要是条件好的话，仅一步就可以纯化到95%，我可以把我们的方法告诉你，你pM你的邮件给我就好了。
72) 1。我的蛋白bind在C4 column 上了，100％的ACN都没办法洗下来，异丙醇也试过了，还有什么好方法？
2。在跑RP-HPLC的时候，如果样品的盐浓度太高了，有影响么？
那实在不型可以考虑极性更低的乙酸乙酯等物质.此外洗不下来有没有可能变性沉淀在柱子上下不来,你的100％的ACN里面有三氟乙酸吗,我觉得出不来的原因有不少,不一定仅是洗脱的问题,所以用反相分离蛋白还是得很小心,此外不知道你的柱子是不是专门用于纯化蛋白的,因为孔径太小也不适合分离蛋白.
ACN 中含有1％的TFE。
有可能是蛋白变性，能用UREA or Guanidine hydrochloride 洗么？
不过在用isopropanol洗的时候，会有一些峰，但好像总是洗不干净
column 是专门用来纯化蛋白的，是C4。 不知道孔径是多少，不过C4的应该都差不多把。
我觉得如果是沉淀也有可能,要不你就少上点样,或者降低上样的浓度,此外尽量洗脱要快点,用变性剂怕不是好的方法,因为浓度太高,很容易有变性剂析出,这样堵柱子或管道更麻烦,你可以开始就增加点ACN 的浓度,这样吸附力弱点,你也可以添加点极性小的溶剂,这样可以避免吸附力太强而洗脱困难.
我想柱子应该没有问题.方法也没有错.
73) 想请教细胞外基质中的蛋白怎样抽提。
这个可真的没有做过,不过一般的做法都是匀浆,然后用缓冲液提取,不知道你的是什么来源的样品,此外如果脂肪含量高可以先用冷的丙酮脱脂肪后再提取,我想细胞外基质中的蛋白也应该是用这些方法吧.
74) 请问聚乙二醇的检测波长是多少？
聚乙二醇是没有紫外吸收的,所以没有检测波长,即使有吸收,那也只在210nm附近有弱末端吸收,而很多物质在这个波长都会有吸收,所以检测它怕是不容易.
75) 怎么有效的去除蛋白溶液中的triton?超滤加PB洗涤是否是一种有效的方法？
你用透析或超滤试试吧,还有个方法是用冷的丙酮沉淀蛋白,这样表面活性剂还是溶解的,这样也可以去除.
用冷的丙酮沉淀蛋白，那么丙酮容易去掉吗？如果试试superfine g-25脱盐的方法去掉triton，可行吗？
丙酮很好去,很容易挥发走了,你也可以用除盐柱子去除,但是如果它是和SDS一样能和蛋白结合,那用通常这些除盐,透析,超滤都没有办法去除,只能用沉淀的办法,而且是用酸性丙酮沉淀才能去除.
76) 那么，mPEG-maleimide的检测波长是多少？
maleimide应该有紫外吸收的,你可以用紫外分光光度器去做全波长扫描,然后可以找到它的特征吸收峰,用这个波长做检测波长就可以,一般的HPLC带二极管列阵检测器也可以做全波长扫描,或者你选几个波长做HPLC也可以,只要没有干扰就可以了.
77) 我现在想纯化一种蛋白，我的蛋白是14kD的碱性蛋白质，流程是这样的：原核细胞内蛋白表达，裂解细胞，SP-sepharose盐离子层析，HPLC Mono S过柱，去盐，HPLC C18过柱，最后得到纯化的蛋白。上面是一个成熟的protocol，我一直没有做过蛋白纯化，所以想向斑竹请教，HPLC上样量这么小，我有5ml的量，要多久才完成？
我觉得为什么要用两次强的阳离子交换柱子呢,直接过一步Source 15 S应该也可以,这样可以省去一步,而后再上HPLC,其实如果你的纯化如果做得好,不上HPLC也有可能,除非你们这个蛋白要求纯度很高,HPLC也有大的柱子,1X25CM的,一次上样可以0.5mL,十次也就完了,我觉得纯化还是尽可能不用HPLC的最好,否则成本高,而且不好放大.
78) 你好,我的目的蛋白是GST融合蛋白，大小为42kD（包括GST)，大肠杆菌表达，我想请教一下其纯化方法。
那很简单,破碎菌体,加pBS缓冲液稀释,上GST琼脂糖凝胶,然后洗平,用10mM还原谷胱甘肽洗脱,收集洗脱峰就可以得到你的蛋白.如果你的蛋白是包涵体,那需要复性再纯化就可以了,我给你发一份我们的材料供你参考.
79) 有没有比较好的国产疏水层析填料，当然是做蛋白的？
国产也有相应的填料的,你pM你的邮件给我,我给你发一份国产的目录,不知道你需要多少量呢.疏水其实和亲和一样,只要配基团密度一样,载量就差不多,还有就是刚性好就可以了,填料的合成也不是很神秘的,更不是不可逾越的.
80) 我的课题涉及多次不同蛋白质的纯化，我现有国外的一个protocol可以参考，但国内实验室的条件有限，担心如果任意更改纯化方法，结果不理想时又不好分析原因。十分地苦恼，想听听您的建议，不胜感激！
我纯化的第一个蛋白质，是由稀释复性而得的三个亚基组成的复合物，这里纯化的目的主要是脱盐更换缓冲液和浓缩(为了下一步的酶催化过程)。我己经用冷冻抽干法将200ml的体系浓缩为10ml，下一步准备用透析脱盐及超滤浓缩，但对于超滤离心管的选择还无头绪（条件有限不可能添置大型超滤设备）,上网查也不得要领，如果您有相关资料，能不能发到我的邮箱？junewu@sohu.com. 关于浓缩的方法，冷冻抽干法、PEG、蔗糖、硫酸胺沉淀法各有何优劣？冷冻抽干法和硫酸胺沉淀法会不会破坏蛋白的活性？蔗糖会不会影响后续的超滤?
我纯化的第二个蛋白质，是经过酶催化的该复合物（110KD），这里纯化的目的主要是去除体系中未组成复合物的单个亚基（36KD、13KD、1KD）及36KD亚基的aggregate，国外的protocol推荐用凝胶层析，但我询问做过的人说分离的效果并不理想（原因不清），我是应该优化凝胶层析的步骤还是应该选用其它的层析方法？没有蠕动泵和收集器（只有层析柱和低温冰箱）能不能做凝胶层析?如果能做如何尽量提高其分离效果？选择层析柱和填料有哪些原则和注意事项?
Native-PAGE时，样品的盐离子浓度和样品内的其它蛋白质会不会影响电泳结果呈阴性？Native-PAGE和一般SDS-PAGE不同之处是否仅仅在于： 凝胶和电泳、上样缓冲液中不加SDS；样品中不加DTT或β-巯基乙醇，不经100℃煮沸处理；电泳时保持较低的温度(4℃)？
问题多多，实在是因为本人是初次涉及蛋白质纯化领域的门外汉，除了您推荐过的书，您还能不能推荐一些专门的网站、公司的操作手册（您如果有买了产品才能获得的，能否也EMAIL惠赠？）谢谢！！！
1.10ml的样品除盐浓缩用透析就可以,这样体积不会变大,同时透析除盐完加PEG8000粉末在透析袋外面就可以浓缩,很方便,超滤包括离心管都不便宜,而且样品不多怕损失多,所以我觉得还是用简单的方法好.
至于浓缩,有条件那用冷冻干燥,超滤都是不错的,硫酸铵沉淀不能当作浓缩的手段,因为它需要蛋白到一定的浓度,而且浓缩后的样品要除盐,回收率也不高,透析袋+PEG浓缩我觉得也是不错的方法,特别适合没有超滤和冷冻干燥的实验室,而且成本低,适合小量不适合大量,蔗糖浓缩我们用过,应该不好用.冷冻干燥和硫酸铵沉淀一般蛋白都不会失活的.蔗糖一般不影响超滤,只是粘度增加,这样超滤会慢的.
2.既然文献是用凝胶过滤,你也用完全没有问题,我觉得分离这些分子量差别比较大的,那凝胶过滤是不错的选择,只要选择好合适的填料,装好柱子就可以,层析的基本条件还是要的,包括泵,检测器,记录仪,要不很难知道收集也不方便操作.填料的选择主要看你的目标蛋白和杂质分子量的差别,例如你的110KD和那些36KD以下的,那你可以这样选择sephadex G 75,你的这些36KD以下都在它3000-80000之内,而你的110KD在外水体积直接就出来,后面的都是小分子的,当然也可以选择Superdex 75,它的分离范围在70000-3000,只是它们价格不同,后面的填料刚性更好流速快,前面的便宜,流速慢些,这些就看你的经费了.
3.电泳别的蛋白不应该影响,但是盐是有影响的,所以样品要除盐,可以用凝胶过滤,透析,超滤除盐.保持底温也许是为了保持蛋白的活性,做小量制备.
4.http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html
这个网站有不少相关的材料,相信很有帮助,此外我可以把我们全部的材料发给你,希望对你有所帮助.
81) 如果分离50KD,36KD,13KD这三种蛋白质，最好选用那种凝胶层析用填料？如何确定需用的层析柱的直径和高度？
2.如果实在没有泵，上样时应注意些什么？没有检测器和记录仪，最短的收集间隔时间是多长？
选择sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的处理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.
2没有泵那我觉得凝胶过滤很难收集样品,除非你用自动分部收集器按一定的体积去收集,然后用紫外分光光度器去扫描测定浓度,这样再根据每管的蛋白浓度做个色谱图,按峰型把各管合并,上样注意要沿柱子的四周缓慢加,最好先把下面出口封闭,让液体不流动,上完样品后再打开下口,这样可以保证上样比较均匀,当胶平面没有液体的时候再用你的平衡液体按上样的方法加就可以,然后再打开下口,千万别让液体流干,也不能把胶平面冲坏.收集的时候可以按5m或者10ml一管,时间是根据你柱子的流速.
82) 请问那里有关于免疫组化Ｓ－Ｐ法具体操作步骤的资料？
SP免疫组化法，全称链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶连接法。你购买的哪家试剂盒都有很详细的方法,或者你上一些提供试剂盒的公司网站联系他们都可以得到详细的材料.
下面的文献你可以看看.
http://www.nhhn.gd.cn/ylkj/zl/z6.htm
83) 师兄你好，
我有一个问题想请教，在以前的贴子中没有看到。我要做抗体的真核表达，为分泌表达，表达出来的蛋白没有标签，因为希望尽可能保持抗体的结构，因此不能用那些针对组氨酸等标签的的柱子，我的抗体是个融合蛋白，大约是IgG的三分之二大小，是sCFv和CH3连接而成二硫键连接的双链，没有CH2区，我看proteinA和proteinG柱子都是要结合FC，那我的蛋白FC不完全的话还能用吗？要不我怎么办啊？还有，对于没有标签的抗体是不是无法和细胞培养使用的小牛血清中存在的抗体样物质分开呀？是不是必须要无血请培养。我简直不知道该怎么设计实验啦。谢谢。
你好，我看的书上说CH3是FC受体的结合区，而C H2是补体结合区，这说明蛋白A和蛋白G应该是和CH3结合的，你可以表达出来用蛋白A或G的试试，此外抗体有很好的疏水性，用疏水色谱也可以用于纯化抗体以及抗体的一些片段，包括单链抗体，至于血清中的抗体，它们和亲和柱子以及疏水等的微小差别通过改变洗脱条件得到纯化，当然你可以用无抗体的血清培养或无血清培养，我觉得你还是选表达出来再说了，而血清中的白蛋白很容易用染料亲和的方法就可以去除。
84) chromatography,您好！我现在用的Ni-NTA进行亲和纯化一个约45KD的蛋白，关于菌体的破碎，有人推荐用溶菌酶，有人说超声波，我用溶菌酶试过一次，但1200undefined20min离心后，上清中没有目的蛋白，你能不能将相关的材料也发给我一份
用超声破碎的比较多,如果你有设备的话这样破碎比较好,因为时间短,破碎效果也好,而溶菌酶不完全,而且不大好操作,我不怎么做上游,不很清楚,你可以再仔细问问别人有关破碎的问题,纯化的材料我给你发一份,希望对你有所帮助.
85) 如果裂解液中加了一些蛋白酶抑制剂，纯化时要不要考虑尽可能最后去掉这些蛋白酶抑制剂？
一般添加的都是小分子的物质,而且也不会和目标蛋白结合,纯化过程一般就去除了,所以不用特别考虑去除的问题.
86) 选择sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的处理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.
1,我们实验室没有sephadex G75(3000-80000)，最接近的就是sephadex G100(4000-160000)，而且都是80年代的产品，如何判断还能不能用？网上可以找到这两种填料的说明书吗?
2,您所说的处理量指的是样品的质量(mg)还是上样的体积(ml)?就我所知有两种计算方法。其一是根据质量算：蛋白质技术手册(汪家政)上说有一种工式：柱直径=(m/10cm)1/3其中m是蛋白的质量(mg),柱的长度=柱直径30，但这个柱直径 的计算公式我没看明白，用不上；其二是根据上样体积算：如果上样量是1ml，按1%的柱床体积则需要100ml树脂，直径1.5-1.6，长度50-60，但如果按2-3%的柱床体积则只需要30-50ml树脂，这样柱参数的变化又极大。您通常是怎样计算的?(具体到我所要分离的蛋白上样量是1ml,包含杂蛋白的总质量是4mg)
3．100ml树脂和50ml树脂对样本的稀释度是不是2:1?
1.G100刚性不好,容易因为压力,盐变化而体积改变,实在没有办法也只能用这个,但是你要保持恒定的流速,,盐或缓冲液的浓度,这样才能保证有很好的分离效果,说明书我想不好找，但是它和所有的sephadex处理是一样的。
2，处理量对于凝胶过滤一般是按体积算，通常上样量是柱床体积的5%左右应该，如果很接近，也可以降低到2%，你的1ml样，1.6x60cm的足够了。
3。一般稀释至少在2以上。
87) 还有个小问题，是不是G后面的数字越大，就刚性越差，越容易受外因素影响？
是的,G后面的数字越大，就刚性越差，越不耐压和盐溶液。
88) 我表达的是带有GST的融合蛋白，醇化后需用凝血酶切割，我想问一下这个凝血酶与临床上用的凝血酶一样吗?
是一样的，但是用于酶切的要求的纯度更高。
89) 在做WB，因为是血清标本，含有较多的白蛋白，可能影响我的实验结果。我请问过ptglab楼主，他推荐我来这儿问一问。请问高手有什么方法吗？哪一种比较简单经济？蓝色琼脂糖凝胶可以分离吗？
用蓝色琼脂糖凝胶就可以去除，我觉得很快也很特异，样品直接穿过柱子白蛋白就可以去掉90%以上，你pM你的邮件地址给我，我给你一份相关的材料，我们这里就有这个填料。
90) 凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析上样时，对样品目的蛋白浓度的要求是不是一样的？样品浓度一般要求在多大范围内？
凝胶过滤处理样品量主要是受体积的影响大，浓度相对要小一些，上样量在床体积5%左右，如果是除盐可以上到20%左右。
其他的主要是上样的浓度，一般就在5-10mg/ml填料，具体的情况得看填料的载量和使用说明。
91) 我问的意思 是在纯化过程中，如果蛋白酶抑制剂去掉了，而该蛋白酶还未去掉，我担心此蛋白酶还会消化我的目的蛋白，请问我说得有没有道理？有没有必要考虑？
你可以用抗体做WB检测你的纯化的蛋白，如果确实有酶解的现象，那你可以在纯化过程中你的缓冲液里加一些抑制剂，然后再做对比，我觉得你考虑得很周到，这个也是值得注意的问题，但是纯化的过程时间不长，一般没有必要这么做，但是有的蛋白有降解的现象，那就加试试。
92) 离子交换层析、亲和层析上样时样品的蛋白浓度可以达到5-10mg/ml？我觉得浓度是不是太大？
抱歉，没有说清楚，我的意思是填料的载量大多在这个范围，所以上样的多少由填料对你的目标蛋白的载量有关，也和填料的性质有关，一般的上样量可以按5-10mg/ml填料的量来上，至于浓度高到5-10mg/ml的样品也没有什么关系，因为其中真正你的目标蛋白不一定很高，所以其实这样的浓度也没有关系，具体的量和浓度还是要经过实验才知道。
93) 破碎菌体,加pBS缓冲液,目标蛋白就可以容于pBS缓冲液了吗？我的蛋白是包涵体。
那你就得用8M的脲或6M的盐酸胍溶解包涵体，然后复性再纯化了，用普通的缓冲液是溶解不了你的目标蛋白的，你的蛋白再破碎后的沉淀里，不在上清中。
94) 你好，我最近做纯化，遇上了两个问题，第一是使用sephrose fast flow做初纯，因为胶不够，我就将一年前使用过的旧胶（放在冰箱里）加入在正在使用的胶里面，出现了怪现象，整个胶变成了絮状， 沉不实，我一看，旧胶里面是有很多絮状物（不是其它东西，也是胶）漂在上面，下面沉淀的是胶，我立即加入了2M的NaCL，这时分层了，絮状物在上面，下面是胶，我于是除去了上面的东西，把下面的胶加上水清洗了三次，又用pH5.0的NaAC
处理了三次，完了，又变回当初的絮状态了，象稳定的絮状胶体一样，真不知到底怎么回事（也就是说加盐它就能沉，加水就絮状胶体），我的胶是不是不能用了？
另外，我做亲和，目的蛋白下面有两条带怎么都去不掉，我的蛋白是4聚体，是不是做SDS－page将它 解离了？我打算做native看看，但是高效液相结果显示很纯的，只是主峰后面有个类似拖尾的小峰，不知道是不是没有分离开，想请你帮我指点一二，另外能不能介绍下亲和方面的资料，非常感谢
你的旧填料是怎么保存的呢,是在20%的乙醇中的吗,你可以把你的填料在抽滤漏斗上去清洗,先用水洗,然后再用0.5MNaOH洗三次,再用20%乙醇洗,70%乙醇洗,水洗,这样你再取出胶在水中混悬看看,应该就好了,如果不好,那就没有办法了,但是一般这么处理应该没有问题.
亲和你用的是什么方法呢,什么填料,HPLC又是用什么柱子呢,是反相吗,我觉得你得先说清楚这样才好分析.
95) chromatography兄,很感谢你的帮助,我这里没有抽滤漏斗,请问那里可以买?贵吗? 我明天用你说得办法处理几次,看看有没有办法解决,如果没有抽滤漏斗,是不是有什莫替代品那?
亲和我使用的是sephrose cl 6B,配基是酶的底物,我的酶是有4个亚基的聚合体,共同存在时才有活性,那两条杂蛋白带在SDS-PAGE中位于主带的下面,洗脱采用底物类似物等pH浓度梯度洗脱,奇怪的是高浓度洗脱纯度较高,一般可以去掉其中的一条杂蛋白,但是另外较小的那条基本很难去除,有杂蛋白存在时酶活往往降低的好快,请chromatography兄帮我分析分析原因,很感激.
这样的砂心漏斗试剂公司就有，不贵，一套也就300来元，没有抽滤还没有别的好代替了，也可以用中间夹膜的漏斗。
至于你说的两条带，那按理你用底物类似物洗脱或pH洗脱会不会有非特异吸附呢，你平衡用什么条件，洗脱呢，你用什么活化的填料，我觉得非特异吸附的情况是存在的，你可以改变洗脱的方式，通常这些非特异吸附是离子交换作用，你可以可以在平衡液里增加点盐，这样可以去除这样的吸附，此外你目标蛋白会不会降解，这样有小分子还一样被吸附，你可以通过抗体做WB看看，如果是这样，那只能在纯化过程中加一些酶的抑制剂来避免。
我能想到的就是这两种情况了。
我是用的硼氢化钠和氢氧化钠活化的，然后加入偶联剂过夜，最后加入配基，采用pH7.5的5mM磷酸氢二钠缓冲液平衡，洗脱是等PH条件下进行的，只不过改变了洗脱剂的浓度，从最大浓度洗脱的结果看，往往就少了其中一条带，你的解释我会认真思考的，亲和中存在离子吸附，是不是目标蛋白和杂蛋白的等电点很接近造成的？平衡液中加点盐，主要起什么作用？一般加多少？使用什么盐好那？如果是我的蛋白解离，这样的杂蛋白有没有什么别的方法洗掉（除了加酶的抑制剂）？
你其实还是没有说清楚你活化的方法，看你的意思好象是环氧活化的方法，不知道你是怎么偶联的，如果你觉得是秘密，那也没有关系，只是你不说我很难判断是不是有非特异吸附，总之要是氨基和羧基缩合的方法，难免有离子交换作用，溴化氰也是这样的，而如果是环氧活化的方法，那么就没有离子交换的非特异吸附，至于盐的浓度可以加0.2-0.5M也足够了，如果是因为降解，那也许用这样亲和的方法就得把条件摸更细致点，如果不行，那可以看凝胶过滤能不能分开，即使不是降解，你也可以考虑凝胶过滤，而从你反映的情况好象杂质是个酶，加点抑制剂看看吧。
真的谢谢你无私帮助，我来到这个公司之前，他们就 已经使用这种方法了『硼氢化钠和氢氧化钠活化的，然后加入偶联剂过夜，最后加入配基』，我也不知道为什么，和经典的环氧等方法不一样，我们偶联剂用的是10个C，培基是带氨基的，硼氢化钠应该是还原剂的，基质是sepharose cl－6B，具体对这方面我不是很了解。我想最近作个native，和SDS对照一下，看看是不是降解，此外，这两条杂带从离子交换的时候它就一直存在的。
我就把胶放在柱子里，加上碱洗了三次，上面的水直接吸走，然后水洗，在加浓盐洗了两次，上面就漂浮着一层悬浮物，我小心再把它从上面吸走，之后在水里面好像就很好了，显微镜下我仔细看，与新胶没什么区别，谢谢你的帮助哦，我只是没有砂心漏斗，没法子试试而已。活化的方法是什么？我自己都不清楚.
96) 1、我们用CM52大量纯化某蛋白，经常会碰到介质裂缝，不知什么原因？
2、离子交换层析时柱高/直径的值有很高要求吗？如果为5/7会对分离有很大影响吗？用PB或ABS平衡时你们一般用多少柱床体积？
3、我们用5KD超滤浓缩后蛋白的损失很大，能否帮忙分析一下原因（PALL 的超滤器）？
那也许是因为有气泡,累积到一定地步后就穿过介质所以裂缝,你流速不能太快,而且缓冲液脱气,这样就应该好了.
2.一般离子交换没有必要算什么高/直径比，一般用的短粗柱子，亲和和疏水也都是这样的就可以，没有刻意要求，5/7应该影响也不大，当然如果你走线形梯度洗脱，也适当把这个比值增加点，如果走阶段洗脱就没有关系。
3。超滤膜本身的面积不小，这样也会吸附蛋白，特别是处理的量比较小的情况损失会很明显，如果量大，那损失会小的，此外如果蛋白不耐剪切力，那么用这样的方法浓缩也要特别小心，因为失活会很明显的。
97) 我做的是原核表达蛋白质，目的蛋白是一个GST-融合蛋白，现在通过SDS-PAGE电泳发现目的条带已经表达出来了，正在做纯化，但是过柱纯化后发现还有其他的几条带，应该只有目的条带的，我就按照分子克隆上说的在过柱前加了点triton-100,但再做电泳发现杂带还有几条，但目的条带却不见了，
1.为什么目的条带不见了？
2、下一步应该怎么办呢？
如果你的有一些别的杂带，那么你可以在清洗的时候多洗几个床体积，此外可以用还原谷胱甘肽做阶段洗脱，你试试，此外加大上样的流速，缩短作用时间，在你的平衡缓冲液中加点盐减少非特异吸附，你的带不见了，可能是
triton-100干扰结合，所以不能用，你用吐温也试试看，因为这个纯化特异性是比较高的，除非你的蛋白有降解现象，你可以用抗体做WB检测看看是不是都是你的目标蛋白，总之修改的方案就是我说的这几个，摸索一下吧。
此外可以选择作用力更弱点的填料。这样特意性更好。
98) 手头有碱性磷酸酶的资料吗？能否告诉我它的详细结构 我想提纯 谢谢拉
最好还可以告诉我想关的提纯方法！它存在于细胞壁与膜之间,大概80K（四聚体）、32KD（二聚体）,它耐高温80度仍然保持活性（在有镁离子存在的情况下）,最适PH8.0
我现在已粗步提取下步想层析, 你看该选择什么材料填柱
蛋白没有什么详细的结构吧，至于纯化它既然是碱性的蛋白，那你可以直接用阳离子柱子做粗步纯化，此外既然它能耐受80度，那你这样处理，大多的杂蛋白就沉淀了被去除，再上离子交换就应该有不错的效果。
填料可以选择CM琼脂糖凝胶和SP琼脂糖凝胶。
99) 前几天我提取了一种菊科植物的蛋白，用的是tris—Hcl缓冲液，然后用100%丙酮沉淀蛋白，结果蛋白中含有色素杂质，属水溶性，颜色很深，请教高手，如何除去色素干扰，纯化蛋白？另外我也查了一些资料，说可能是花色素，于是我在100%丙酮沉淀后，加了一步0.1%甲醇，但是并没有显著的效果。
你说的花色素就是黄酮类的花青素吗，它有很强的亲水性，所以丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了，你试试吧。
100) 用PB（pH6.8）或ABS(pH4.0)平衡时你们一般用多少柱床体积？10X够了吗？
一般也就3-5个床体积吧，离子交换需要平衡体积大点也，10X足够了
101) 有个关于胰岛素精纯化的问题想向你请教，我已取得95%纯度样品。但杂质大于1%，进一步纯化，用什么柱子，具体操作又怎样做呢，谢谢赐教。
我知道，我好象回复过，你用反相硅胶10um的柱子1.0X25cm或者2.2X25cm的柱子做制备，这样可以达到99%以上的纯度，别的方法很难做到你需要的纯度，此外胰岛素也可以用等电点沉淀的办法去掉一些杂质。
HPLC制备你可以参考相关的文献，其实也就是甲醇水或者乙腈水含三氟乙酸，先是低浓度吸附，然后提高浓度洗脱，详细的条件和你做反相纯化是一样的，只是HPLC的分离效果更好。
102) 请问怎样可以查到protein的PI值？，多谢了先！
已知的蛋白当然是查资料,未知的如果知道序列的话,可以用软件,你在论坛中搜索吧,有不少帖子的.
103) 谢了chromatography兄，也就是必需用小颗粒的硅胶填料了。
是的,需要用HPLC做制备,或者你优化的你工艺,看能不能提高纯度.
104) chromatography兄:
非常感谢回复，我手里也有一个GST融合表达的项目，经纯化后，用EK酶切时，出问题了。
目的蛋白是12KD左右，PI约PH9.5。用PH8.0，0.1M NACL条件酶切时，反应液发混，全部沉淀，切出的蛋白（约12KD）经尿素溶解，透析后，PH6.0不能挂上CM柱。用PH8.0，2mM CaCl2条件酶切时,也有发混，但目的蛋白有14KD左右，PH6.0可以挂上CM柱。不知是不是酶切条件有问题？
另外，chromatography兄，有化学破菌及EK酶切相关文献吗？给我发一份好吗，E-mail:zhangxstc@yahoo.com.cn
别客气,有沉淀也许是蛋白在那样的pH下溶解度不好,或者因为缓冲液的原因,挂不住会不会是没有切开,所以挂不柱.最好用电泳看看切的效果如何.
至于破碎我不很清楚,酶切你可以参考下面的东西:
http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins
105) 我想用DEAE纤维素来做填料
我的粗提酶液蛋白含量大约为7mg/ml我该选择哪个型号的DEAE呢？
DEAE纤维素要是同一家公司的差别不大,最常用的也就是DEAE纤维素 DE-52,其实我觉得你还是选择DEAE琼脂糖凝胶,流速也快,好用,没有什么必要一定用纤维素,何况价格也不便宜.你做的是什么酶呢.
106) 我想请问一下您在装柱（尤其是分子筛柱子）是否是按照填料的说明正向装呢，还是反向装？
我两种方法都试过的，但是只有一次是正向装完后，检测效价为30，000。请问装柱过程中除了填料和水要脱气和填料要一次性的倒入外，还有没有其他要注意的。最好能给我一个Protocol。谢谢！
另外，还有一个问题，我有一个90kD的融合蛋白（连GST），用GST的亲和柱纯化后总是有50多kD和20左右的杂蛋白。我用Sephacryl－S100能去掉它们吗？或者您可以给我一个更好的建议
1，我不明白，当然是正向装了，反向怎么装呢，其实装柱子只要均匀就可以，我几乎没测定过柱效，也没有Protocol，因为一般装的都没有问题，只要注意你说的几个问题就可以。
2。至于纯化的杂带你用抗体做WB看是不是降解的物质呢，你可以优化你纯化的条件，在平衡液体中提高盐的浓度，这样可以降低非特异吸附，这样再做做看，此外你可以用5mM,10mM.20mM还原谷胱甘肽阶段洗脱看看有什么结果，我觉得你先优化完如果没有纯化好，再用凝胶过滤吧，你可以选择sephadex G75或者是Superdex G-75，这样你的目标蛋白在外水体积中出来，后面的杂质在内水体积中，这样效果会更好点，如果用前面的S100不会比后面的两个填料效果好的。
107)
108) chromatography 大哥
我做的是碱性磷酸酶,大约32KD,我现在只做到硫酸氨盐析粗提,想进步纯化,你那有没有层析方面的资料,（比如材料的选择原则、洗脱液的选择、操作等方面）
这个蛋白硫酸铵沉淀后你可以直接用疏水,要不就透析,然后上阳离子交换的柱子,这样纯化不知道能到多少纯度,此外可以用亲和的办法,我看到的是把物质偶联到琼脂糖凝胶上做亲和,例如对氨基苯磷酸.洗脱用磷酸盐竞争洗脱就可以,这是比较好的方法.我给你发一份填料选择指南吧,也许会有的有点用处,此外把我见到亲和的文献发给你一篇
chromatography 大哥, 谢谢你拉, 资料我收到了, 我先看看还有问题在找你帮忙了,定向合成化学配基亲和层析纯化碱性磷酸酶, 新型染料配基对碱性磷酸酶的亲和纯化 是什么格式的我这解压缩后打不开了
文件是zip格式的,有winzip这个软件就可以打开了,应该很常见的.
109) chromatography 辛苦
我想纯化碱性蛋白酶, 具体方法设计如下:
65%硫酸胺沉淀,透析袋.
但是我的蛋白酶蛋白含量不损失是严重,不知道还有什么好的方法浓缩.
下一步纯化方法DEAE50, G200两种填料
不知道注意什么?谢谢
别客气,我不太清楚你说的但是我的蛋白酶蛋白含量不损失是严重,是什么意思,是损失严重吗,按理透析不应该有太大损失的,你可以用缓冲液把透析袋里面洗几次,这样能降低你的损失.其实上离子交换,不需要浓缩,直接上就
摘自中国色谱网
1) 白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。
请我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60％左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用0.5％CHAPS助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。
既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了，我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液PH值，看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。
2) 请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶？
亲和的填料合成过20来种,你是希望用它来纯化某种脱氢酶吗,我看FMN可偶联的有限,倒是FAD有活泼的氨基好偶联,何况它们几乎是同一个辅酶,你是不是考虑把FAD连上去.当然FMN的结构上也有个仲胺,可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上,而溴化氰活化或别的活化的介质都不大好,因此我觉得这个没有什么问题.
此外如果是以FMN为辅酶的,那我还可以建议 你试试蓝色琼脂糖凝胶,因为它的配基的结构和FMN的三个环很相似,它能纯化不少脱氢酶和激酶.如果它可以你就不需要合成填料了,有现成的.
我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择自己适合的活化介质。
不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。
我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定，配基脱落少。我觉得是不错的选择。
包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说.我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件.
层析复性很时髦,但是真正能用的不很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。
3) Sephadex G-25（medium）柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗？若有，一般对盐浓度限度如何？
大家别客气，除盐对于浓度应该也是有一定的限制的，同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，但是在正常的范围如1-2M应该影响不大，不过要除得很干净还是尽量少上点样品，我觉得上样的体积毕竟比浓度的影响更大。
4) 我的蛋白17kd左右，能跟肝素亲和，一般用离子交换和亲和层析纯化，
现在我用聚乙二醇修饰它 ，分子量增加5000左右，修饰率不可能达到100％，请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开？（当然修饰后还残留有聚乙二醇，这个小分子也要除掉）
他们大多用凝胶过滤，我觉得这也不错的做法，毕竟PEG是链状的分子，在柱子上和普通蛋白行为不一样，修饰度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白选择sephadex G50试试，它的范围在1000-30000，应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链，修饰后的蛋白疏水性增强，修饰度越高，疏水性越强，可以用这个原理分离。离子交换也可以选择，因为同样道理，修饰度越高，电荷被屏蔽也越多，电荷也越少，因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的道理，你可以试试，你手头的亲和能不能分开，你在这几个方法里选择看哪个更经济好用就可以。
5) 我是个新手，谢谢楼主给我解决了许多难题。
我有个问题困绕很久，从细菌中提取酶，好象用常规的方法（超声波破壁，缓冲液提取），总是拿不到我要的蛋白。是不是这种蛋白也是疏岁水性较强，需要加助溶剂才能提取出来？另外，我是不是也可以加点甘油或者PEG来提取？
其实这个问题我觉得是这样的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目标蛋白的分子量你是应该知道的，那么跑电泳先看它到底是在上清还是沉淀里，剩下的问题你再解决如何提取。
对于不同的酶要看酶稳定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾经提取一个酶用水就是提取不出来，需要用盐才能提取出来，多试试，设计个方案，这样才能解决问题，所以不一定加甘油就管用，你还得注意破碎本身会不会有问题，倒回去做做也许能找到真正的原因。有什么问题继续探讨。
6) HPLC是用来分析检测or分离纯化？
如果可以用来纯化，上样量那么小有什么意义呢？
如果是用来分析检测，怎样指导以后的分离纯化工作呢？
HPLC既可以做分析也可以做制备，纯化上样量小，这样分离效果好，就可能得到很纯的物质，同时配合质谱等就何以得到很多单一蛋白的特性包括序列等，这些纯度高的组分是用一般的纯化方法做不到的。HPLC重现性好,定量准确,所以也可以用于定量和定性,是分析中不可缺少的工具.
分析出来后如果这个物质很稳定，直接线性放大就可以做大规模的制备，因此摸好了分析的条件也就相应有了制备的条件。
7) 利用蔬水性质，用反向HPLC方法分离的原理？（包括洗脱液的选择和谁先被洗脱下来等），请chromatography兄详细点。
反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反像是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱，选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。
疏水的填料疏水集团密度只是反相的10%左右,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.
疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具.
8) 求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知道下边该怎么做？望赐教!
这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21表达
你好，我做复性不多，你可以依据有关有多对4对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的，还有用分子伴侣，你可以多看看再尝试：）
至于纯化，如果你的蛋白有游离的巯基，那我觉得很时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知道现在还有没有这个填料，你可以问pHarmacia公司的人。你pM给我，我可以把这个材料发给你，如果没有，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样类似分级沉淀，你就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯化。这样省事点。
9) 我想用一个短肽（5肽）作配基亲和纯化一个可与它特异性结合的蛋白（67kda），用什么填料比较好，您有什么好的见意？谢谢
对于小分子的配基我觉得需要有一定的亲和手臂，否则由于位阻很难有很好的分离效果，说到活化填料的选择我多说几句，大多人都会选择溴化氰，但是这样做的介质一般杂吸附多，此外没有亲和手臂，所以对于小分子的配基有时候纯化效果不好，此外本身对介质也没有交联作用，所以刚性也差，如果经常用极端pH洗脱配基脱落也多，这是它的一些缺点。
环氧活化的琼脂糖凝胶可以有很多的手臂选择，刚性也好，没有非特异吸附，形成的键比别的活化方法更稳定，因此合成的亲和介质性能更出色，你可以选择这样的方法，偶联很简单，你pM你的邮件给我，我可以把一些材料发给你，供你参考。
10) 我目前作的一个蛋白药物的分子量大约是7000， 等电点4，目前要去除内毒素有何简单可行的方法？（此蛋白已经纯化好，但检验内毒素不过关）
你用过分子筛吗？superdexG75对你这种蛋白比较合适。做之前请先用1MNaOH 1ml/min平衡2小时。这种方法除内毒素，非常有效。
如果问题请与我联系。myhok@sina.com，我们以前去除都是用去内毒素亲和的填料直接加到样品中震荡40小时左右,就可以,可以做到<10EU/mg
11) 请问HPLC是在蛋白复性后做比较好，还是在HPLC之后再来复性？？？
复性做得不多,柱上的复性更少,但是就感觉而言还是尽量在柱后复性,因为这样好放大,而且容易操作,对于HPLC的柱子很容易因为沉淀而堵柱子,包括很高的变性剂对机器也不好,也可能因为流速慢而结晶堵住管道等,很复杂,虽然有一些这样的例子,但是我觉得真正操作还是麻烦,何况这样做的量也不大.所以还是选择纯化后复性吧.
12) 我想问问：我把小分子偶连到填料上纯化其兔多抗，用什么结合缓冲液和洗脱缓冲液好？
我现在拟的是：
Binding Buffer:
20mM Tris,1M NaCl,pH 8.0
Elution Buffer:
50mM 柠檬酸，pH 3.0
应该没有问题,如果挂得不好,你可以把Binding Buffer中的1M NaCl去掉,不知道你用什么活化的载体,如果是CNBr,那就得加,但是我们发现有时候盐也可以洗脱下来东西,你试试再说吧.
洗脱你可以用pH 5.0 4.0 3都试试,如果在高一点就可以洗下来,没有必要用太低的,怕对活性有影响
13) 这段在用离子交换柱纯化蛋白，我想问一下，洗脱采用的离子强度的大小范围，应该如何确定，可以根据什么来调整洗脱时的离子强度
一般采用的盐浓度的范围在0-2MNaCl之间，怎么确定得配合你的洗脱的峰的电泳结果来确定，最直接的就是你的目标蛋白，如果在很早就出来，那你洗脱的盐浓度（离子强度）就不用太大，如果出来的很晚或一直没有出来，那就选择更高的盐浓度。
当然你也可以选择用阶段洗脱的方法，这样比较容易放大，分离效果其实也不错，虽然摸索要麻烦点，但是重现性好，也一样可以做得很纯，而且能很精确知道在多少浓度下洗脱出来。我比较喜欢用这种洗脱方法
14) 你好：我有一个困惑了好长时间的问题，想请教。我的蛋白是2KD，在做非还原电泳时，发现除了目的蛋白外，有二聚体和多聚体存在。目的蛋白占44%，余下大部分为二聚体和多聚体。但在做反相HPLC时，只出现两个峰，第一主峰占90%（目的蛋白的位置），出峰时间为13分钟，第二主峰占10%，出峰时间为3分钟。请问在做HPLC时，二聚体和多聚体是否发生改变？用此方法测定含有二聚体和多聚体存在的目的蛋白纯度，是否不妥？我用柱子是C4柱，5υm,300埃。流动相B用0.05%三氟乙酸的乙腈，流动相A用0.05%三氟乙酸的纯水。
我觉得蛋白的聚合应该和存在的环境有很大的关系，但是即使如此，那聚合体在反相上能有这么大的差别吗，你可以用HPLC的凝胶过滤柱子在走一遍试试，或者你把第一个峰和后面的峰都跑电泳看是不是都是蛋白，如果第一个峰也是蛋白，那说明你推断是对的，如果不是，那就是没有分开。
我觉得测定聚合体还是用高效凝胶过滤色谱更好点，非还原电泳也应该不错，反相你可以查查文献有没有这么检测的。
目前检测protein aggregation的方法主要有四种。
1。gel filtration. 根据专门的mark，可以推断大致的聚合物的分子量，不过实际应用上看，影响的因素太多了，结果很不精确。
2。native gel. 大致上可能可以推断聚合的程度，不过结果实在不能让人信服。通常要与其他结果配合说明问题。
3。Dynamic light scattering：简单方便，结果可信，常用于挑选蛋白结晶的条件。但是对于浓度有限制。
4。超高速离心。
文献中多见1，3联用，3 explains the status of protein, and 2 explain the status of concentration-dependent aggregation.
有时也见过1，2联用的，不过仅用于说明次要问题。
15) 请教阁下：我想把一种配基连接到环氧活化的琼脂糖上制备亲合介质，但是这种东西在一定比例的有机溶剂（如二氧六环）和水混合溶液中才溶解，似乎看过文献提到，有机溶剂会影响琼脂糖，不知如何处理这个问题？谢谢。
完全没有问题，因为有些琼脂糖凝胶活化时就在有机溶剂中，所以它们本身不会影响到活化后的琼脂糖的，相反在有机溶剂中环氧基团更不容易开环。所以你不用担心，你的配基稳定的话你可以用0.1MNaOH溶液混合你的有机溶剂室温偶联24小时就可以。
16) 最近我在用sephadexG-75的胶纯化蛋白，总共膨胀了3次新胶（其中第一次是一个批号，后两次是同一个批号），第一次是90度9个小时，加BSA4度过夜，第二次是按照安玛西亚上的时间90度3小时，还放在120度高压锅内灭菌，没有加BSA，第三次同第一次做法，结果发现，第一次的胶一开始的流速很快，根据说明书上给的线性流速可以达到37cm/h，而且分辨率很高，但后来两次，线性流速最快的时候也只有17cm/h，分辨率低得多，不知道是什么原因？？？？（我们用的玻璃管都是一样的型号）
这都很正常的处理应没有问题,但是还放在120度高压锅内灭菌不知道行不行,此外你用什么液体处理的填料呢,pH是在中性吗,在酸性和碱性条件下有可能会使结构破坏的,你可以测定一下.如果pH没有问题,那应该说填料本身没有问题.至于流速你的样品会不会比较粘,你柱压高不高, 如果柱压高,那填料变形压缩,那流速自然慢,而且分离效果不好,你的样品会不会有核酸或多糖,这样会影响的,因此你还是看看柱床体积有没有变化,如果缩小很明显,那你就重新装柱子.
17) 我们用c-18反向柱纯化蛋白，用的流动向是1%三氟乙酸，乙腈，不知道这两种东西，在什么浓度对蛋白有变性作用。
反相一般都是做分析的多,除非你的蛋白很稳定,否则不大适合做纯化,因此在有机溶剂中都有变性的可能,一般10%左右短时间应该没有问题,高了就很难说了,当然这也很蛋白本身关系很大,如果你真的想纯化,那建议还是改C3或C4这样温和点,你的有机溶剂也不需要很高的浓度就可以洗脱,也许会好点,你可以配合你的活性测定找到一个合适的浓度使你的蛋白活性回首率更好,纯化过程一定要快这样也降低变性的可能.
18) 我有一单抗腹水，第一次纯化时，我先用50％硫酸铵沉淀，然后上HiTrap desalting脱盐，再过MonoQ强阴离子交换柱，用IFA检测抗体活性，合并收集峰，最后进行透析。第二次纯化时，是直接将腹水上脱盐柱，没有经过硫酸铵沉淀，结果两次纯化结果，第二次所的蛋白浓度是第一次的三倍多，纯化的抗体我主要是用来做胶体金标记，请问两种纯化过程， 对抗体的纯度会有什么影响，是否会对标记效果产生差别？
腹水中应该有一些脂溶性物质以及一些别的杂质,沉淀后应该更干净点,直接过柱子要注意清洗,至于这两个方法具体效果如何,你可以跑电泳检测,同时也可以做抗体的活性检测,如果没有什么差别,那当然是回收率越高越好. 具体怎么样只有检测后才知道.
19) 用HPLC分析得到的结果对我们用普通的层析柱纯化有什么指导意义吗？
我觉得有意义如凝胶过滤的柱子,那可以知道分子量的分布以及别的信息,而如果是反相可以知道哪个蛋白的疏水性强,用离子交换的柱子可以知道电荷的不同,总之了解的信息越多对纯化越有用,所以说都是有意义的,只是很少有先做HPLC后做纯化的,大多先纯化后用HPLC分析.
20) 离子交换层析，一般用氯化钠洗脱，可以用氯化钙洗脱吗？
没有问题,是盐都可以,只是小心钙离子容易和磷酸盐产生沉淀,你可以用别的缓冲液就没有问题.
21) 我想请问高效凝胶过滤色谱柱那种比较好，用什么流动相，PH 多少为好？目的蛋白是2KD。
别客气，其实高效凝胶柱子一般用TSK系列的最多，你可以看看有没有分离范围窄点的柱子，只怕难有分离范围这么小的凝胶柱。流动相用缓冲液就可以。其实按你的分子量，用反相例如C3或者C4更合适，你也可以直接用C18的试试试，凝胶柱很贵，如果用不了那不是可惜了。
补充一下，由于分子量小，可以用MS来估计disulfide bond是否形成。形成一个，分子量减少2（失去两个proton）。
至于复性，建议在纯化之后进行。有文献证明，蛋白复性，成功的可能随纯度的提高而提高
因为HPLC用的填料一般是5-10um的,而通常用的填料至少也在35um以上,分离效果差别还是很大的,如果要把这么细的填料装在普通的柱子上,压力很大,一般的泵和系统,包括柱子根本承受不了那么大的压力,此外普通的层析系统的泵的精度管道等都很难保证有很高的分离效果,但是你可以把HPLC的条件直接用普通的填料来放大制备,例如你摸好了HPLC的反相或者亲和以及离子交换的填料,如果它们有相应的颗粒大的普通的填料,那就可以直接用HPLC上的条件,这样只要你HPLC的条件很好,那就可以,但是高效凝胶过滤色谱难在普通的柱子上放大,它也没有相应的填料.
22) 你所提及的样品如含有核酸或多糖会影响sephadexG-75柱的流速及分辨率,具体何解？
我觉得是这样的：凝胶过滤的原理是小分子能进入的孔到多于大分子的，但是如果有多糖或核酸的干扰（很粘），这样一些小分子也不能进入更多的孔（和没有干扰的相比），这样自然分离效果不如没有干扰的。这是其一。
其二是由于这些东西粘度大，那么同样流速下，由于sephadexG-75压力比平常的大，所以胶会压缩变形，这样它的内孔和没有干扰的排阻极限也不同，所以分离效果自然比没有干扰要差。特别是压缩会使孔变得不均匀。
当然相对而言，前面的原因是最主要的，后面是次要的。
其实不仅是凝胶过滤，别的色谱有这两物质（还有一些脂溶性的物质）也会一样干扰传质，因此影响分离效果。所以这两个东西一般要小心，同时它还会降低柱子的寿命。
23) 我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．我想试用硫酸铵分级沉淀除去部分杂蛋白，再过s-100.但不知硫酸铵分级沉淀该如何具体操作？
你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱，此外其实你的蛋白分子量很小，杂质应该大多分子量比它大，你直接过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来，或者上superdex 30 大于10KD的先出来，而你要的在后面，然后你再用离子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质没有前面说的那两种好，此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和蛋白一起出来的，你测定样品的电导看看。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，你可以设计你的实验，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
24) 如果怀疑是多糖造成的黏度过大，请问应该如何去处多糖？
多糖去除你可以用硫酸铵分级沉淀,也可以用低温乙醇分级沉淀.一般的多糖也不带电荷,你可以用离子交换挂住你的蛋白,这样也是可以的
25) 问一个有关DEAE Sephadex A 50的问题，我的填料处理好后别人拿去用了，用了一次，结果我把他放到烧杯后，发觉已成絮状，不知有没有坏掉？可以再用吗？用什么方法可以把它恢复到原状？
这个絮状的东西有颜色吗，会不会是染菌了，或者是脏的东西没有处理干净，你可以用0.5MNaoH泡半小时，沉淀后倾去上清，做三次这样的处理，如果还有不干净的东西，你可以用6M盐酸胍泡半个小时，然后处理和NaoH一样，再换水，这样你看能不能洗回来，如果不能很好沉淀下来，那就不能用了。凝胶类的填料很容易长菌，用完得洗干净，保存在20%的乙醇中。
26) 我想在想纯化peg修饰的蛋白，可是我目前只有弱阳离子交换的羧甲基纤维素，你看能不能纯化阿，好像文献上都用sp-sepharose，纤维素是不是不行啊？另外，目前没有专门的层析装置和蠕动泵，我用普通的层析柱是不是就可以阿，流量是不是也不用太精确阿？谢谢！
离子交换的方法是可以的，但是我觉得疏水也很值得一做，因为修饰后电荷变化了，其实疏水性也增加了，所以这些方法都可以，此外只要你的CM纤维素能挂住就可以分离，，SP-sepharose只是更强点，而且流速更好点，你先试试，不行再换吧。没有蠕动泵纤维素流速会比较慢吧，流量肯定不精确，我觉得还是有个泵好点，没有检测器也不行，这些是纯化的基础，要不可是比较麻烦的，怕实验难重复。何况你没有泵也没有办法做线性剃度洗脱。反正是太简单点。
27) 问一个有关DEAE Sephadex A 50的问题，我的填料处理好后别人拿去用了，用了一次，结果我把他放到烧杯后，发觉已成絮状，不知有没有坏掉？可以再用吗？用什么方法可以把它恢复到原状？
这个絮状的东西有颜色吗，会不会是染菌了，或者是脏的东西没有处理干净，你可以用0.5MNaoH泡半小时，沉淀后倾去上清，做三次这样的处理，如果还有不干净的东西，你可以用6M盐酸胍泡半个小时，然后处理和NaoH一样，再换水，这样你看能不能洗回来，如果不能很好沉淀下来，那就不能用了。凝胶类的填料很容易长菌，用完得洗干净，保存在20%的乙醇中。
28) 首先我想问一下agarose和sepharose区别,我的理解是:都指琼脂糖,但agarose是未连接其他介质的,而sepharose是连接其他介质的,不知理解对不对?请指教!Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是一种东西吗?
其次,我想问一下你纯化过GST融合蛋白没有?我现纯化一个融合蛋白(某种酶和GST融合),我买了SIGMA公司的GLUTATHIONE-AGAROSE五毫升,但我不知怎么做.分子克隆说直接将亲和介质于细菌裂解液混允离心....我不知我买的可不可以这样做.而产品说明书上说做柱子,我就想1毫升的柱子怎么做,装介质的柱子的高度和直径有要求吗?
agarose是通常的琼脂糖的英文名称，大家都这么叫，它不是商品的注册名称。而sepharose是amersham的琼脂糖凝胶的注册商品名称。所以你理解是有偏差的，此外agarose不一定是琼脂糖凝胶，而Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是同一类东西，只是厂家不同。
GST融合蛋白纯化过，5ml的凝胶你可以装在1.6x20的柱子上用，也可以按照分子克隆的做法做，取决于你的喜好和方便。1ml不好装，除非有专门的小柱子，对于直径和高度没有特别的要求，我们的做法是：
1、 GST琼脂糖凝胶FF装柱，0.7X2.5cm，柱床体积为1ml；
2、 用缓冲液1平衡5个床体积，流速为1ml/min；
3、 将10ml发酵液用缓冲液1稀释到20ml，0.45μm滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；
4、 用缓冲液1再洗10个床体积，流速为1ml/min；
5、 用缓冲液2洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰
6、 用纯水洗5个柱床体积，再用20%的乙醇洗5个柱床体积，流速为1ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存
缓冲液组成：
缓冲液1：20 mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2 M NaH2PO4 19ml，0.2 M Na2HPO4 81ml加水至1000ml。
缓冲液2：50mM Tris-盐酸缓冲液，pH8.0，配制：0.1M Tris 50ml，0.1 M 盐酸29.2ml，307mg还原型谷胱甘肽，加水至1000ml。
29) 请问con A sepharose 4B 亲和凝胶使用前的处理方法？
不需要特别处理，直接平衡后就可以上样了。
30) 谢谢，我想问一下，是不是离子交换必须要线形梯度洗脱比较好呢？还是阶段洗脱好？检测器我想先收集然后再去测紫外。
也不是,有的时候阶段洗脱效果就很好,而且容易放大,不需要仪器,我比较喜欢,效果差不多,但是很省事.但是关键是容易重复.紫外分管测定那也可以,我上学也那样做过.
31) 我要从总蛋白中提出250KD的NF1蛋白做western，由于量少所以要做免疫沉淀。我是利用小鼠来源的NF1单抗与兔抗小鼠IgG、protein A－sepharose来做免疫沉淀，发现做完后跑电泳，出现了两条带，分别位于85KD、55KD左右，请问这会是什么东西？会是抗体吗？还有没有可能是目标蛋白变小了？
抱歉,我没有做过免疫沉淀,但是抗体做过一些,抗体重链没有大到85KD的地步,所以应该不是抗体.会不会你的蛋白有四个部分构成,分别是两个85KD和55KD,这样分子量正好和你的250KD相当,你可以跑非还原电泳看看,是不是还这样呢.如果不是,那说明是由这两个部分组成的.都是由二硫键连接的.
32) 我提胰蛋白酶，主要参考用张龙翔书里的办法，先提卵类粘蛋白，首先过SEPHADEX G-25 柱子脱盐，然后过DEAE纤维素离子交换柱；第二步是用卵类粘蛋白合成SEPHAROSE-4B亲和柱。这些层析过程都可以在缓冲液里面加0.02%的叠氮化钠抑菌吗？以后怎样去除？
我提胰蛋白酶粗酶用的乙醇，可以用异丙醇或正丁醇或其它的低分子醇吗？浓度多大为好？
那实验我知道，你用什么方法活化琼脂糖呢，胰蛋酶的亲和纯化方法很多，配基有大豆胰蛋白酶抑制剂，抑肽酶，苯甲脒类，特别是后面的苯甲脒，可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶，何必自己去提取呢，感觉比较复杂，自己偶联这些配基也可以，层析过程不需要加0.02%的叠氮化钠抑菌，尽量不要加，那透析或者除盐柱子都可以，或者直接上一样的亲和柱子，用不含这个的缓冲液洗，最后洗脱下来就可以了。
最好还是用乙醇，浓度很难说，因为和你的蛋白浓度有关，别的醇用得很少。此外你可以考虑用硫酸铵沉淀，这样对活性更好些。纯化也可以用疏水，因为它在苯基琼脂糖凝胶柱子上能被吸附，配合硫酸铵沉淀也是不错的选择。
33) 楼主,我想问一下phenyl-sepharose CL-4B有没有浓缩作用,以前有人做过,克也在纯化时,浓缩5-10倍,可是,我却没有使纯化的蛋白浓缩,我想得到浓度较高的蛋白,又想省去浓缩这步,楼主能不能指点我一下,缓冲液的流速以及柱子的选择上有什么要求,使洗脱下来的蛋白浓度会较高,
亲和，疏水，离子交换都可以浓缩样品，但是离子交换是最便宜的，苯基可以浓缩，但是想有好的浓缩效果，最好用一次洗脱或者阶段洗脱的方法，我建议你先用离子交换柱子挂住，然后直接用高盐洗脱，因为不知道你蛋白的等电点，所以不知道你该选什么柱子。如果样品含盐高，那可以用疏水，然后直接用缓冲液洗脱就可以。亲和也差不多这样的。流速没有太大的要求，柱子看你手头有什么，离子交换是最常用的。上点样
34) 我做的是青霉素酰化酶,样品盐浓度很高,我是两步纯化,第一步使用氧化铝物理吸附,使用含有1.7mol/L(即200g/L)硫酸铵的ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗脱的.第二步想用phenyl-sepharose CL-4B脱盐和浓缩,可是效果很差,基本是起不到浓缩的作用.
我做了好几次,都是这样,可是前面有人做的时候起到浓缩的作用,我现在却做不出来,也联系不上以前做过的人.
phenyl-sepharose CL-4B使疏水层析,我现在就这种柱子,我想问的是装填料的时候用的玻璃柱株高和直径的比值大的还是小的,洗脱蛋白时会使洗脱的蛋白峰值高一些,谢谢
这个酶纯化应该可以用亲和的方法做吧,其实只要把青霉素G偶联到琼脂糖凝胶上就可以特异用于这个酶的纯化.苯基琼脂糖凝胶浓缩可以,但是除盐不好,你想浓缩效果好,你可以把硫酸铵的浓度提高到2.5M再挂在柱子上,直接用ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗就应该可以.你想浓缩的效果好,那尽量用短粗柱子,也就是径高比大的柱子.这样扩散少些.此外要用高载量的填料,颗粒细点,起始盐浓度高点,这样保证能浓缩好你的样品.
35) 楼主：这段在用离子交换柱过抗体，请问抗体的吸收图谱是怎样的？它的特征吸收峰在哪里，不同的多克隆抗体是不是还有自己的特征吸收峰，
抱歉,你是说色谱图还是紫外吸收图呢,蛋白一般都是在280检测的呀,不同的的蛋白虽然有一点差别,但是那也不是很明显的,其实就用280就可以了.
36) 我的蛋白以GST融合蛋白的形式表达在E Coli中，分子量14~15kDa，蛋白的疏水性很强，等电点在7左右。菌破碎后，用表面活性剂提取的融合蛋白，据文献说是由于此蛋白和细胞膜结合，所以如果不加表面活性剂，上清中电泳检测不到。加表面活性剂后，提取效率还可以。上GST 胶。开始时采用先洗脱融合蛋白，再酶切，洗脱采用10mM GSH洗脱，没有加表面活性剂。然后酶切后，就会产生大量沉淀，上清中没有目的蛋白。后来在酶切buffer中也加表面活性剂，就得到了改善，没有再出现沉淀，目的蛋白也存在于上清中。目的蛋白中仅有一个cys。
我的问题是：
1、老板不知从那看了篇文献，是专门讲此蛋白的结构的。不过人家的蛋白是合成出来的，然后用反相C18（300A孔径）分离的。他非要我不上GST胶（因为binding 效率不是很高，GST价格很贵，工业化好像也没几家），提取液先酶切，沉淀后离心上反相分离。我觉得沉淀中的杂质组成不很清楚，如果有大一点的蛋白变性沉淀之类，用反相会不会很容易堵柱子？我看一些资料，反相只用来分离或分析短肽，较少用于分离较大的蛋白，尤其是我的杂质都不清楚的情况下。
2、过去曾做过superdex200 10/300分离酶切产物时，由于目的蛋白聚集，我也没有marker，每个峰较难定性，电泳看不出来，可能是浓度太低。我想用反相有没有可能建立一种便捷的分析方法来分析纯化过程中目的蛋白的量？
3、我的蛋白酶什么好的测活方法，只能做细胞毒性试验。有一篇文献说在生理条件下，我的蛋白没有二级结构，尽管在一定浓度下未沉淀，但是都以多聚体存在，如果加入50% TFE(三氟乙醇，trifluorethanol),则可使其在中性pH下恢复二级结构，此时大部分以二聚体存在。那么，你用过TFE防止聚集么？这样做有什么根据么？好象一般都只用表面活性剂（对细胞有毒性），或L-arg，PEG之类的，可我没找到在L-arg和PEG存在下，目的蛋白的结构功能方面的文献。现在不清楚多聚体是否就一定没有活性？郁闷阿，望多多指教！
4、我的GST结合效率不很高，总有部分流穿（应该没有超过载量），而放慢流速改观也不明显，后来结合的时候binding buffer中也加表面活性剂稍微好一点，但还是不满意。我曾试过把流穿收集再进GST柱，可是几乎不结合，所以我怀疑GST部分可能有变性和不变性两部分。我曾看过一文章，提取时采用离子型表面活性剂，binding时在加入triton X-100，采用混合表面活性剂，据说可以使GST部分复性，增加binding，我还没有试过。
您有这方面的经验么？多谢了
1,其实反相价格会更好点,因为有机器,柱子和流动相也不便宜,其实我们用的是国产的GST融合蛋白的纯化系统,价格就不贵,你PM你的邮件给我,我给你一份材料,反相柱子其实做不了多少东西,所以建议你别用它制备.
2.只要你有标准蛋白,那用HPLC做分析代替电泳是很不错的,因为这样时间缩短了,效率更高,而且定量很准确.
3.三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(环境极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.
4.至于你柱子挂得少,那有可能是因为有些目标蛋白的结构和能挂上的不一样,那你可以试试降低上样的浓度,包括降低疏水性,加表面活性剂看看,这个不做怕是不知道的,因为只要GST没有活性或被屏蔽,那肯定挂不上.
37) 色谱兄能否推荐几种不错的离子交换介质呢？我现在知道有羧甲基纤维素，sp-sepharose等，但是砝码西亚的sp-sepharose太贵了，450/25ml。你能推荐一下比较不错的介质吗？物美价廉的，谢谢！
维素不好操作,还是用琼脂糖的吧.我用的是国产的.你可PM你的邮件给我.我给你相关的材料.
38) 一是电泳后凝胶里面德蛋白质有什么可靠的方法回收？
二是我现在有个GST融合蛋白，用thrombin酶切后的目的蛋白条带很弱，请问可能是什么原因有什么办法解决
还真没有做过,你可以用电洗脱的方法,然后浓缩可以用离子交换不就行了或者透析袋加PEG8000浓缩,只怕这样会变性了.
你酶切带弱,那可以尝试增加酶的量,或延长酶切时间,.此外看有pH有没有问题,你的蛋白浓度是不是太低.
39) 我所说的大颗粒是指蛋白或病毒颗粒。这些颗粒的直径会大于填料的孔径。谢谢！
完全没有问题,我用琼脂糖凝胶6B给病毒除过盐,也纯化过,这样可以把很多小分子的蛋白去除,再过离子交换就可以比较纯了病毒.病毒都可以,那大分子的蛋白也没有问题,包括质粒也可以用凝胶过滤纯化.
40) 谢谢chromatography的答复。介质有现成的，但很贵啊。我要分离谷胱甘肽还原酶，文献都是用2',5'-ADP－Sepharose 4B纯化，以后你多留意点，
别客气,我的意思是你用兰色琼脂糖凝胶试试,此外有谷胱甘肽琼脂糖,应该也可以用来纯化谷胱甘肽还原酶吧,或者专门合成一个类似底物的也可以,其实你完全可以自己合成填料的.也许这样能很好地解决你纯化的问题.
41) 我用环氧氯丙烷活化琼脂糖，到哪儿可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶？GOOGLE 搜不到。我们没冷室，层析过程加什么来抑菌？我将层析柱放冰箱里层析以防长菌和防酶降解，可以吗？
环氧活化的琼脂糖凝胶你要偶联什么配基呢，我有国产甲脒琼脂糖凝胶的材料，你pM你的邮件，我把材料发给你，层析过程水是流动的，所以不会长菌，不需要抑菌，层析柱灌满20%的乙醇，放在冰箱4度中保存很久都没有问题。
42) 查尔酮合成酶的酶活要用同位素方法测定，而我的条件没办法测所以需要送到别的地方测。这会造成很大的麻烦，请问chromatography 有没有人做过的，有没有好的方法可以借鉴？另外一个问题是：利用分离纯化这个蛋白的填料中有没有亲和偶联剂？我一直都没有查到过。
这个酶应该和查尔酮以及苯基酮都有特异的亲和力,你完全可以自己合成一些亲和填料,我们用的是国产活化好的琼脂糖凝胶合成不少亲和介质,效果不错,我觉得你可以用亲和的办法,即使是苯基琼脂糖凝胶也可以纯化这个蛋白.因为它和芳香环有很特异亲和力.
你说的亲和偶联剂是配基还是活化的填料呢.
43) 请问，如果所提蛋白质浓度低，如何进行浓缩或纯化。我试过丙酮沉淀法，但沉淀很难溶解，没法往下作了。有没有更好的方法？谢谢！
那你直接把你的样品放在透析袋中，然后在外面用PEG8000粉末浓缩，这样就好了，你也可以超滤浓缩。丙酮沉淀要在低温搅拌情况下缓慢加冷丙酮，避免局部浓度过高，此外沉淀后马上离心，这样也可以避免变性而不溶解。
44) 三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(环境极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.
关于TFE对于a-helix的形成，现在有两种观点。
1。TFE能稳定a-helix的形成，及这个蛋白本来就是a-helix的结构，但是由于dynamic太严重了，或其他的因素，造成表观上看不见。加入TFE能够稳定之，使之表观可见，用CD啊什么可以看得到。
2。TFE能使蛋白变成a-helix。及这个蛋白本来不是a-helix的，但是由于加入TFE的作用，使之变成a-helix。
具体的原理我就没仔细读了，不过这两方都有一定的文献证明，现在还不知道谁对！ ^_^
45) 我是需要在兔肝中纯化一种酶,而且我是刚刚接触蛋白纯化我有几个问题想请教:
1 : 我的目的蛋白在强阴离子柱上结合(buffer : 25 mM 磷酸盐 PH 7.4),但是似乎结合力很弱(因为上样时就有少量蛋白flowthrough,而且洗脱峰在电导值刚开始升高时就开始出现了),我换用了20mM Tris PH 8.2 buffer 之后,蛋白的结合力好像还是很弱,洗脱峰没多大改变.请问我用 PH 8.5 Tris buffer 会改善我的问题么?
2: 由于目的蛋白丰度低易失活,而且实验室浓缩的条件有限,我过了脱盐柱和粒子柱后样品蛋白含量低体积大,我想请教:我接下来大体积上疏水柱能行么?会很大的影响我的分辨率么?我的蛋白在疏水柱上结合力很强,总是到梯度最末才洗出来,我该怎样优化一下?
3:我有亲和胶(red A) ,但是由于经济上的原因不能用特异的含配体的溶液洗脱,只好用高盐的洗脱液(含2M KCl),这样是不是分离效果很差?值得我去用梯度洗脱么?(因为我没有空柱,上不了机器,只能用手工做,这样做梯度很是麻烦)
4:天然的肝脏匀浆梯度离心后,在PH 7.4 的磷酸盐平衡液下,为什么绝大部分(95%以上)蛋白都结合不上去呢?我最好要把PH值降到多少去试?6.8合适么?
谢谢你的指导!!
1.你可以用5-10mM缓冲液上柱子,同时pH调为8.5,这样可能会好些,此外如果还是很弱,那你可以用Q柱试试.提高pH应该有用,但是有的蛋白吸附力弱,所以盐一高挂不住,因此要降低到5-10mM也许能更好点.
2.大体积直接上疏水没有问题,既然你的目标蛋白是最后出来,那你可以用0.5-1M盐洗去杂质,然后用0.1M洗脱,根本不需要走梯度,这样快,分离效果也不差,而且这样洗脱的体积小,容易放大.
3.你说的Red A 是procion red HE-3B吗,是染料亲和吗,既然这个填料可以,那么蓝色琼脂糖凝胶也可以,它们都属于染料亲和,这个应该更便宜点,洗脱用盐没有关系,不需要竞争洗脱,何况那样染料很难去干净.手工洗脱,你可以用阶段洗脱的方法,如你用0.5,1,1.5,2M的盐阶段洗脱就可以,不需要走梯度,只要你多摸索,你会找到个合适的浓度,效果一样很好,没有问题.
4.挂不上你是指的亲和还是离子交换呢,我想如果是亲和,那你可以降低pH,同时还一个缓冲体系,我觉得主要在pH,你降低到4-5那挂得就比较好一些吧.
46) 1.我正是用的Q柱出现的上述问题,
2. red A 确实是一种染料亲和,
3.我说的挂不上是在souce 30 S 和streamline sp上样的体积
4.你用akta的设备么?我用purifier 100 ,发现电导值总是稍迟于开始的梯度.
1,那你按我提议试试吧,降低缓冲液浓度,提高pH值.
2.那它的结构和我说的那个染料是一样的吗,你也可以试试蓝色琼脂糖凝胶,都是颜料,结构也相似.
3,挂不上那也可能,不知道你挂的是用什么条件,这个酶等电点是多少呢.
4.AKTA就是那样的,因为梯度是从一开始就算,而电导至少要近一个柱床体积才有变化,所以稍迟.
47) 你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱，此外其实你的蛋白分子量很小，杂质应该大多分子量比它大，你直接过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来，或者上superdex 30 大于10KD的先出来，而你要的在后面，然后你再用离子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质没有前面说的那两种好，此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和蛋白一起出来的，你测定样品的电导看看。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，你可以设计你的实验，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的目的蛋白仍挂不上 SP柱（我是一个新手，正在做蛋白纯化．我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．），是不是理论IP与实际有相差？
48) 有可能还在柱子上,如果你所有的组分都检测了没有活性,那这样的可能性很大,你可以用0.5,1M的NaCl分别洗脱,再测定这两个洗脱组分的活性看看.你的酶稳定吗.
我的酶还算比较稳定，４C下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变，－２０C时间就更长了。
49) 问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，很多人都这样说，所以科室里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。
50) 多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的目的蛋白仍挂不上 SP柱（我是一个新手，正在做蛋白纯化．我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．），是不是理论IP与实际有相差?
理论上的和实际是有差别，但是不会这么大，你的样品中盐的含量高不高呢，有盐也会挂不住的。
51) 我的酶还算比较稳定，４C下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变，－２０C时间就更长了。
我分别用了０．５Ｍ，１Ｍ的NaCl洗柱子，测蛋白浓度还是很低，中间有几个管浓度较高，然后测酶活却发现活性依然很低，上柱前测的还有４４１IU／１０ｕｌ，而收集管里的顶多只有２０IU／５０ｕｌ。
所以，我很怀疑它到底挂在柱子上没有，于是我检测了一下上柱后用初始缓冲液洗脱下来的收集液，发现酶活居然有１００IU／５０ｕｌ，我想是不是初始缓冲液的离子强度就太高了呢，０．０１１Ｍ柠檬酸－氢氧化钠，PH５．５？然后就用的是手工步进式洗脱，０．０５Ｍ，０．１Ｍ，０．１５Ｍ，０．２Ｍ，０．２５ＭNaCl，直到后来的０．５Ｍ，１Ｍ．
另外，我还想请教您：
阳离子层析柱用完后如何保存？先用１M氢氧化钠溶液，然后再用含硫柳汞的缓冲液，行吗？可不可以用其他的防腐剂呢？如有，可否推荐一下？硫柳汞我这里包装大，２５ｇ，又不能分装，需要避光保存，先谢谢了！
那用更高点的盐洗脱看看，例如2M，如果还是没有下来，那也许是沉淀在柱子上了，可是如果吸附，你的穿透应该活性很小才是，可是穿透好象有不少，是不是没有挂住呢。
保存你用20%的乙醇过柱子就可以，然后在低温4-8度就可以，没有必要用硫柳汞。
52) 问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，很多人都这样说，所以科室里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。
纯化和表达系统有一些关系，但是最重要的还是看蛋白的特性，所以不一定真核就不好纯化，所以我觉得不用担心。纯化的方法你可以用离子交换等纯化方法，具体很难说，得看你的目标蛋白而定。
53) 你好,我想请教一下,我现在在做包涵体蛋白的柱上复性和纯化,是上的疏水柱.疏水上柱要求硫酸铵的浓度在1.75M以上,但是高浓度的硫酸铵在6M的盐酸胍中不能溶解,不知道你是否碰到过这类问题.而且我的蛋白又不能用8M的尿素溶解.缓冲液现在用的是50mM的磷酸二氢钠,PH7.5.还想请教一下,上样的浓度有要求么?不知道你有什么好的建议呢,谢谢.
要复性你的蛋白浓度就不能高，这样你溶解你的目标蛋白也就不需要那么高的盐酸胍了，这样你就可以把盐浓度提高点。上样浓度应该小于0.1mg/ml，具体情况得看你的蛋白，我建议你可以用简单点的稀释复性或者透析试试，如果不是特别复杂的复性最好能用简单的方法，别过柱子。
54) 不好意思，什么叫穿透啊？不懂唉，请指教。
另外，我还想问一下“交换纤维素解离基团的pK值”？，“用阴离子交换纤维素时要选用低于pK值的缓冲液，用阳离子交换纤维素时要选用高于pK值的缓冲液。”是什么意思，谢谢！
所谓穿透就是上样后用及平衡缓冲液洗下来没有被吸附的部分叫穿透,pK值用于表示酸碱性的强弱,阴离子交换的填料是碱性的,所以你需要用用缓冲液pH小于pK值这样它才能带正电荷,用于交换带负电荷的样品,否则就挂不上样品.而阳离子是需要缓冲液pH高于pK值,这样它才能解离带负电荷,用于吸附带正电荷的样品.否则也挂不住.
55) 我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带，特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您有什么高见，谢谢。
这样纯化的蛋白可以免疫动物,没有问题
56) 向您请教一个问题，我用pET28载体、宿主菌BL21(DE3)表达目的蛋白，目的蛋白的两端都带His-tag,蛋白的大小为37kD，在利用Ni-NTA纯化时总是在目的蛋白带旁边伴随一条带去除不了，请问有什么高招可以解决这个问题？!!!此外，该表达产物为包涵体，请问这种产物可不可以直接用来制备抗体？谢谢！！！
也许这两个都是你要的目标蛋白呢,会不会是这样呢,你可以用his的抗体做WB看看是不是这样的,如果是,那说明是这样的情况.此外你可以再平衡缓冲液中加0.5%的吐温等表面活性剂,这样可以去除一些非特异吸附,此外你可以用pH45左右的变性溶液去洗,这样也能去掉一些杂质,最后在用咪唑溶液洗脱.如果你这样都去不掉,而做WB也有两条带,那说明可能是降解,超声破碎的时候功率别太大,时间也别太长,注意温度,因为超声有时候也可能会使蛋白降解.
57) 我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带，特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您有什么高见，谢谢。
你可以在你的平衡缓冲液里加一些盐,0.2-0.5MNaCl,这样可以降低一些因为离子作用带来的非特异吸附.同时在平衡液里加0.5%吐温等表面活性剂,这样是不是有点改善,此外你也可以用阶段洗脱的方法,例如用5mM和10mM还原谷胱甘肽去分别去洗脱,这样看看有没有什么区别.此外还要注意的问题是超声破碎时注意功率和时间.避免过强时间过长,降解蛋白.
此外你可以GST抗体做WB看是不两个都是你要的东西，会不会是降解或造成这样的结果。你可以加点酶的抑制剂，此外抱歉我不是主任，嘿嘿。
58) 我准备用30％－60％硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？
30％－60％硫酸铵沉淀可能对你的目的蛋白来讲，太粗略了，如你所言，目的蛋白可能在沉淀中，可否分级沉淀，３０％－５０％，５０％－６０％，再测一下活性可能就分开了，20mg/ml的蛋白浓度对于层析是有点高，洗脱液浓度变化或PH的改变都会使蛋白有损失，最好不要超过１０mg/ml。
59) 我的蛋白是用pGEX-4T载体在BL21中表达的，表达量很高，形成包涵体，为了获得可溶性蛋白，我现在尝试用较低浓度的诱导剂诱导，此前用不同浓度诱导做过对比，电泳后表达量的差异不大；但当我再降低温度诱导后发现，超声处理后的上清液中目的蛋白条带很微弱，大部分目的蛋白还是在沉淀中；这和我降低诱导剂前做的不一样（同温度），为什么目的蛋白的可溶表达会不稳定呢？对同一菌种应该是固定的吧？我很迷惑．
另外，请问，一般情况下２８度，３０度诱导时间应该分别多少才合适？我们的光度计出了点问题，无法测定ＯＤ值．谢谢．
还有，你有没有较好的蛋白纯化的文献介绍几篇，好吗？
60) chromatography 兄，请教一个问题:
选择填料的时候，CM和SP怎么选择？什么时候选择弱阳？什么时候选择强阳？
再问一个：
我们实验室有两种蛋白，一种等电点5左右，另一种等电点9左右，为什么都可以用CM阳离子交换纯化？（用的缓冲液都呈中性）
等电点5的那个我觉得选择阴离子交换柱好些，为什么不这样？
没有什么特别的原则，重要是纯化的效果好就可以，一般都是先选择弱的．
纯化是把目标蛋白和杂质分开就可以，所以其实在这样的情况下，酸性蛋白是挂在阴离子柱上，而后面的挂不住，但是只要能把它们和杂质分开就可以．所以酸性蛋白流穿，杂质被吸附也可以，所以不一定非要吸附也可以．
61) 我准备用30％－60％硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？
也不是，其实沉淀你可以做仔细点，例如先用３０％沉淀，取上清，再把上清加到４０％，然后如此类推，一直到６０％，然后测定沉淀和最后上清的活性，这样就知道哪样的浓度沉淀效果比较好，既然你的活性都在沉淀里，那直接溶解在一定浓度的盐中，直接过滤上柱子就可以，浓度高也没有关系．
62) 急问：我的样品蛋白液本来放在４C保存，谁知有人把温度调到了１８C已有一天，请问这样对蛋白会有多大影响？我纯化的是一种酶。另外，树脂在这样的温度下性质会有所改变吗？某人说４C－３０C的情况下，树脂不会有太大改变。是这样么？谢谢！
不知道你的蛋白稳定不稳定，你可以测定一下活性看看，如果没有什么变化，那就没有关系，树脂不会因为温度有什么变化的，尤其是你的树脂不是以蛋白为配基的亲和填料．，没错在４C－３０C的情况下是没有多少改变，但是那也看多长时间，什么树脂，因为时间长会长菌如果不加抑菌措施的话．
63) 我用鼎国的sepharose 4-B 合成亲和柱可以吗？
是活化好的吗，还是普通的琼脂糖，他们的填料颗粒有的比较粗，不知道你选择的粒径是多少范围的，最好要细一些，４５－１６５um比较好，用一般应该没有问题．
64) 比如说，sephadex G-25的分级范围是1000～5000，我想问一下，分子量小于1000的分子（例如盐）是怎么样通过的？它是从凝胶内部通过吗？不是说只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过吗？
凝胶的中间有的是大小不同的孔,盐自然在这些孔中间通过,而所谓的分离范围也只是说在这样的分子范围内有差别,离开这个范围就没有分离效果,所以小的和大的都没有什么分离效果,因此不是只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过.而是在这个范围的分子有分离效果.
65) 请教：要从发酵液中纯化出一个分子量约为1100的具有抗菌活性7肽，前期的提取采用的是酸沉醇提的方法，粗提物中蛋白含量39mg/ml。资料上说，纯化这个小肽要用sephadexLH-20，可是我没有。：（尝试用sephadax G15 进行了纯化，出现了五个没有分开的峰，第六个峰分的还算可以。考虑到可能是粗提物中的组分太多，于是对粗提物用sephadex G200进行了纯化，得到一个单一峰，收集后，冷冻干燥，再过sephadex G50，得到两个吸收峰，可是实验发现，这两个吸收峰没有抑菌活性了：（洗脱液用的是pH7.0的PBS，检测波长280nm。请问可能出现的问题有哪些？洗脱液选择的有问题？检测波长有问题？｛我的这种多肽，资料上说HPLC的检测波长为210nm,也有205nm的。｝
你的问题很不明确,用sephadexLH-20纯化除了有一部分凝胶过滤外,还有一些分配色谱的作用,所以这个介质和sephadax G15 是不太一样的,你纯化出多少峰都应该进行抑菌实验,否则很难知道你要的组分在哪里.既然这个分子量这么小,那你上sephadex G200,估计你的目标多肽在最后面,所以你得到的那个峰不一定有你要的东西,而在后面,我是这样猜测的,关键你要测定活性,所以你再纯化也没有活性,问题在于你没有时时做活性检测,填料选择不很正确,检测波长我不清楚对不对,关键你要选择合适的柱子,同时每一步都做活性检测.
我确实是对每个峰都作了抑菌实验,Sephadex G15的每个峰都有抑菌活性.粗提物上G200只得到了一个吸收峰,要是我要的组分在后面,可它连个小峰都没有呀.。此外，有人建议我，先使用硅胶柱对粗提物进行处理，请问可供选择的柱子有哪些？谢谢。
那你没有说明G200的峰是不是有活性，你也可以考虑硅胶填料，那得选择c8或者c4的反相硅胶的柱子，可以做HPLC，这样也是不错的选择，毕竟通常的凝胶柱子很难有很好的分离效果。
66) 如果我用sephadex G-25脱盐，如何选择缓冲液？因为我认为，如果选择含盐的缓冲液，本身带入了盐，能起到脱盐的效果吗？如果选择含盐的缓冲液，
缓冲液里含有的盐会最后流出来吗？ 另外，分子筛有没有载量的问题？
缓冲液选择看你需要什么缓冲液就选择什么,没有什么特别的要求.你的缓冲液当然是没有盐的,否则那何必除盐呢.含盐缓冲液当然不能去掉盐了,它只能把你样品中的盐去除,用的原理是蛋白在柱子中走得比盐要快,所以先出来.如果你缓冲液中有盐那虽然盐有后出的原理,但是因为你一直用含盐的缓冲液去冲柱子,所以它的盐是去不掉的,这和样品中的盐是不一样的.
分子筛其实也有载量的问题,但是关键还是看上样的体积,例如分离上样体积不能大于10%柱床体积,脱盐不能大于30%,具体的数和样品有很大关系.
67) 既然这样，我想完全脱盐时，洗脱液可以选择水吗？因为缓冲液中的缓冲对总会有盐的存在，对不对？
是的,只要你的样品在水中溶解得很好,而且很稳定,那选择水就可以.
68) 请教色谱兄，我现在用纤维素分离纯化蛋白和peg-蛋白，跑完我用page检测了一下，没有完全分开，有一些是一起流出来的，我想知道为什么分离效果不好？我该如何调整阿？加长柱子可行吗？还是要更换介质阿？我用的梯度洗脱。多谢拉！
peg-蛋白要想完全分开是比较困难的,因为PEG修饰的程度不一样,所很难完全分开,不过纤维素分离的效果是要差点,你可以通过延长柱子,降低流速,延长梯度的办法来提高分辨率,不行你可以换琼脂糖系列的,但是我觉得你也可以考虑疏水,这两个方法都可以.此外洗脱你也可以用不同盐浓度阶段洗脱,这样有时候分离效果也不比梯度的差.
69) 非常感谢色谱兄，琼脂糖的比纤维素的好很多吗？另外，上次你给我了份材料没有价格，能否给份有价格的材料，这样也好和老板谈谈，因为老板控制的挺严，谢谢！！flyhyx@yahoo.com
有的，到时候发给你吧。琼脂糖肯定比纤维素分离效果要好，载量也大，还有就是柱床体积不会变化，流速高。
70) 想请较：质粒纯化中超螺旋和线性的如何实现有效分离（制备规模），且不使用plasmidselect之类亲和介质。
亲和是最有效的方法，我们有现成的工艺，包括去内毒素，你可以把你的邮件pM给我，我给你发一份相关的材料，你可以看看。
71) 我所纯化的蛋白质大概是66kDalton，进行的亲和纯化。现在出现几个问题想请教：
1。用的Ni-NTA进行亲和纯化，以前一直是在250mM咪唑中洗下目标带，现在50mM就有，是不是我的镍柱不太好使。
2。因为亲和纯化后我的蛋白在最上面，所以我现在用sephadex G－100，但是我发现效果很差，不仅回收率低，而且也只有小分子量的杂带能去掉。因为在我的目标带下面不久就有一个小的杂带，而且我想把我的蛋白去结晶，那样要求的纯度就很高。这样的话是不是选用的纯化材料不对，而且对于流速和柱子长度要求就很严格了。
有可能你的载量下降了，所以才那样，你需要清洗了。
我觉得你最好选择新的填料，其实你要是条件好的话，仅一步就可以纯化到95%，我可以把我们的方法告诉你，你pM你的邮件给我就好了。
72) 1。我的蛋白bind在C4 column 上了，100％的ACN都没办法洗下来，异丙醇也试过了，还有什么好方法？
2。在跑RP-HPLC的时候，如果样品的盐浓度太高了，有影响么？
那实在不型可以考虑极性更低的乙酸乙酯等物质.此外洗不下来有没有可能变性沉淀在柱子上下不来,你的100％的ACN里面有三氟乙酸吗,我觉得出不来的原因有不少,不一定仅是洗脱的问题,所以用反相分离蛋白还是得很小心,此外不知道你的柱子是不是专门用于纯化蛋白的,因为孔径太小也不适合分离蛋白.
ACN 中含有1％的TFE。
有可能是蛋白变性，能用UREA or Guanidine hydrochloride 洗么？
不过在用isopropanol洗的时候，会有一些峰，但好像总是洗不干净
column 是专门用来纯化蛋白的，是C4。 不知道孔径是多少，不过C4的应该都差不多把。
我觉得如果是沉淀也有可能,要不你就少上点样,或者降低上样的浓度,此外尽量洗脱要快点,用变性剂怕不是好的方法,因为浓度太高,很容易有变性剂析出,这样堵柱子或管道更麻烦,你可以开始就增加点ACN 的浓度,这样吸附力弱点,你也可以添加点极性小的溶剂,这样可以避免吸附力太强而洗脱困难.
我想柱子应该没有问题.方法也没有错.
73) 想请教细胞外基质中的蛋白怎样抽提。
这个可真的没有做过,不过一般的做法都是匀浆,然后用缓冲液提取,不知道你的是什么来源的样品,此外如果脂肪含量高可以先用冷的丙酮脱脂肪后再提取,我想细胞外基质中的蛋白也应该是用这些方法吧.
74) 请问聚乙二醇的检测波长是多少？
聚乙二醇是没有紫外吸收的,所以没有检测波长,即使有吸收,那也只在210nm附近有弱末端吸收,而很多物质在这个波长都会有吸收,所以检测它怕是不容易.
75) 怎么有效的去除蛋白溶液中的triton?超滤加PB洗涤是否是一种有效的方法？
你用透析或超滤试试吧,还有个方法是用冷的丙酮沉淀蛋白,这样表面活性剂还是溶解的,这样也可以去除.
用冷的丙酮沉淀蛋白，那么丙酮容易去掉吗？如果试试superfine g-25脱盐的方法去掉triton，可行吗？
丙酮很好去,很容易挥发走了,你也可以用除盐柱子去除,但是如果它是和SDS一样能和蛋白结合,那用通常这些除盐,透析,超滤都没有办法去除,只能用沉淀的办法,而且是用酸性丙酮沉淀才能去除.
76) 那么，mPEG-maleimide的检测波长是多少？
maleimide应该有紫外吸收的,你可以用紫外分光光度器去做全波长扫描,然后可以找到它的特征吸收峰,用这个波长做检测波长就可以,一般的HPLC带二极管列阵检测器也可以做全波长扫描,或者你选几个波长做HPLC也可以,只要没有干扰就可以了.
77) 我现在想纯化一种蛋白，我的蛋白是14kD的碱性蛋白质，流程是这样的：原核细胞内蛋白表达，裂解细胞，SP-sepharose盐离子层析，HPLC Mono S过柱，去盐，HPLC C18过柱，最后得到纯化的蛋白。上面是一个成熟的protocol，我一直没有做过蛋白纯化，所以想向斑竹请教，HPLC上样量这么小，我有5ml的量，要多久才完成？
我觉得为什么要用两次强的阳离子交换柱子呢,直接过一步Source 15 S应该也可以,这样可以省去一步,而后再上HPLC,其实如果你的纯化如果做得好,不上HPLC也有可能,除非你们这个蛋白要求纯度很高,HPLC也有大的柱子,1X25CM的,一次上样可以0.5mL,十次也就完了,我觉得纯化还是尽可能不用HPLC的最好,否则成本高,而且不好放大.
78) 你好,我的目的蛋白是GST融合蛋白，大小为42kD（包括GST)，大肠杆菌表达，我想请教一下其纯化方法。
那很简单,破碎菌体,加pBS缓冲液稀释,上GST琼脂糖凝胶,然后洗平,用10mM还原谷胱甘肽洗脱,收集洗脱峰就可以得到你的蛋白.如果你的蛋白是包涵体,那需要复性再纯化就可以了,我给你发一份我们的材料供你参考.
79) 有没有比较好的国产疏水层析填料，当然是做蛋白的？
国产也有相应的填料的,你pM你的邮件给我,我给你发一份国产的目录,不知道你需要多少量呢.疏水其实和亲和一样,只要配基团密度一样,载量就差不多,还有就是刚性好就可以了,填料的合成也不是很神秘的,更不是不可逾越的.
80) 我的课题涉及多次不同蛋白质的纯化，我现有国外的一个protocol可以参考，但国内实验室的条件有限，担心如果任意更改纯化方法，结果不理想时又不好分析原因。十分地苦恼，想听听您的建议，不胜感激！
我纯化的第一个蛋白质，是由稀释复性而得的三个亚基组成的复合物，这里纯化的目的主要是脱盐更换缓冲液和浓缩(为了下一步的酶催化过程)。我己经用冷冻抽干法将200ml的体系浓缩为10ml，下一步准备用透析脱盐及超滤浓缩，但对于超滤离心管的选择还无头绪（条件有限不可能添置大型超滤设备）,上网查也不得要领，如果您有相关资料，能不能发到我的邮箱？junewu@sohu.com. 关于浓缩的方法，冷冻抽干法、PEG、蔗糖、硫酸胺沉淀法各有何优劣？冷冻抽干法和硫酸胺沉淀法会不会破坏蛋白的活性？蔗糖会不会影响后续的超滤?
我纯化的第二个蛋白质，是经过酶催化的该复合物（110KD），这里纯化的目的主要是去除体系中未组成复合物的单个亚基（36KD、13KD、1KD）及36KD亚基的aggregate，国外的protocol推荐用凝胶层析，但我询问做过的人说分离的效果并不理想（原因不清），我是应该优化凝胶层析的步骤还是应该选用其它的层析方法？没有蠕动泵和收集器（只有层析柱和低温冰箱）能不能做凝胶层析?如果能做如何尽量提高其分离效果？选择层析柱和填料有哪些原则和注意事项?
Native-PAGE时，样品的盐离子浓度和样品内的其它蛋白质会不会影响电泳结果呈阴性？Native-PAGE和一般SDS-PAGE不同之处是否仅仅在于： 凝胶和电泳、上样缓冲液中不加SDS；样品中不加DTT或β-巯基乙醇，不经100℃煮沸处理；电泳时保持较低的温度(4℃)？
问题多多，实在是因为本人是初次涉及蛋白质纯化领域的门外汉，除了您推荐过的书，您还能不能推荐一些专门的网站、公司的操作手册（您如果有买了产品才能获得的，能否也EMAIL惠赠？）谢谢！！！
1.10ml的样品除盐浓缩用透析就可以,这样体积不会变大,同时透析除盐完加PEG8000粉末在透析袋外面就可以浓缩,很方便,超滤包括离心管都不便宜,而且样品不多怕损失多,所以我觉得还是用简单的方法好.
至于浓缩,有条件那用冷冻干燥,超滤都是不错的,硫酸铵沉淀不能当作浓缩的手段,因为它需要蛋白到一定的浓度,而且浓缩后的样品要除盐,回收率也不高,透析袋+PEG浓缩我觉得也是不错的方法,特别适合没有超滤和冷冻干燥的实验室,而且成本低,适合小量不适合大量,蔗糖浓缩我们用过,应该不好用.冷冻干燥和硫酸铵沉淀一般蛋白都不会失活的.蔗糖一般不影响超滤,只是粘度增加,这样超滤会慢的.
2.既然文献是用凝胶过滤,你也用完全没有问题,我觉得分离这些分子量差别比较大的,那凝胶过滤是不错的选择,只要选择好合适的填料,装好柱子就可以,层析的基本条件还是要的,包括泵,检测器,记录仪,要不很难知道收集也不方便操作.填料的选择主要看你的目标蛋白和杂质分子量的差别,例如你的110KD和那些36KD以下的,那你可以这样选择sephadex G 75,你的这些36KD以下都在它3000-80000之内,而你的110KD在外水体积直接就出来,后面的都是小分子的,当然也可以选择Superdex 75,它的分离范围在70000-3000,只是它们价格不同,后面的填料刚性更好流速快,前面的便宜,流速慢些,这些就看你的经费了.
3.电泳别的蛋白不应该影响,但是盐是有影响的,所以样品要除盐,可以用凝胶过滤,透析,超滤除盐.保持底温也许是为了保持蛋白的活性,做小量制备.
4.http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html
这个网站有不少相关的材料,相信很有帮助,此外我可以把我们全部的材料发给你,希望对你有所帮助.
81) 如果分离50KD,36KD,13KD这三种蛋白质，最好选用那种凝胶层析用填料？如何确定需用的层析柱的直径和高度？
2.如果实在没有泵，上样时应注意些什么？没有检测器和记录仪，最短的收集间隔时间是多长？
选择sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的处理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.
2没有泵那我觉得凝胶过滤很难收集样品,除非你用自动分部收集器按一定的体积去收集,然后用紫外分光光度器去扫描测定浓度,这样再根据每管的蛋白浓度做个色谱图,按峰型把各管合并,上样注意要沿柱子的四周缓慢加,最好先把下面出口封闭,让液体不流动,上完样品后再打开下口,这样可以保证上样比较均匀,当胶平面没有液体的时候再用你的平衡液体按上样的方法加就可以,然后再打开下口,千万别让液体流干,也不能把胶平面冲坏.收集的时候可以按5m或者10ml一管,时间是根据你柱子的流速.
82) 请问那里有关于免疫组化Ｓ－Ｐ法具体操作步骤的资料？
SP免疫组化法，全称链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶连接法。你购买的哪家试剂盒都有很详细的方法,或者你上一些提供试剂盒的公司网站联系他们都可以得到详细的材料.
下面的文献你可以看看.
http://www.nhhn.gd.cn/ylkj/zl/z6.htm
83) 师兄你好，
我有一个问题想请教，在以前的贴子中没有看到。我要做抗体的真核表达，为分泌表达，表达出来的蛋白没有标签，因为希望尽可能保持抗体的结构，因此不能用那些针对组氨酸等标签的的柱子，我的抗体是个融合蛋白，大约是IgG的三分之二大小，是sCFv和CH3连接而成二硫键连接的双链，没有CH2区，我看proteinA和proteinG柱子都是要结合FC，那我的蛋白FC不完全的话还能用吗？要不我怎么办啊？还有，对于没有标签的抗体是不是无法和细胞培养使用的小牛血清中存在的抗体样物质分开呀？是不是必须要无血请培养。我简直不知道该怎么设计实验啦。谢谢。
你好，我看的书上说CH3是FC受体的结合区，而C H2是补体结合区，这说明蛋白A和蛋白G应该是和CH3结合的，你可以表达出来用蛋白A或G的试试，此外抗体有很好的疏水性，用疏水色谱也可以用于纯化抗体以及抗体的一些片段，包括单链抗体，至于血清中的抗体，它们和亲和柱子以及疏水等的微小差别通过改变洗脱条件得到纯化，当然你可以用无抗体的血清培养或无血清培养，我觉得你还是选表达出来再说了，而血清中的白蛋白很容易用染料亲和的方法就可以去除。
84) chromatography,您好！我现在用的Ni-NTA进行亲和纯化一个约45KD的蛋白，关于菌体的破碎，有人推荐用溶菌酶，有人说超声波，我用溶菌酶试过一次，但1200undefined20min离心后，上清中没有目的蛋白，你能不能将相关的材料也发给我一份
用超声破碎的比较多,如果你有设备的话这样破碎比较好,因为时间短,破碎效果也好,而溶菌酶不完全,而且不大好操作,我不怎么做上游,不很清楚,你可以再仔细问问别人有关破碎的问题,纯化的材料我给你发一份,希望对你有所帮助.
85) 如果裂解液中加了一些蛋白酶抑制剂，纯化时要不要考虑尽可能最后去掉这些蛋白酶抑制剂？
一般添加的都是小分子的物质,而且也不会和目标蛋白结合,纯化过程一般就去除了,所以不用特别考虑去除的问题.
86) 选择sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的处理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.
1,我们实验室没有sephadex G75(3000-80000)，最接近的就是sephadex G100(4000-160000)，而且都是80年代的产品，如何判断还能不能用？网上可以找到这两种填料的说明书吗?
2,您所说的处理量指的是样品的质量(mg)还是上样的体积(ml)?就我所知有两种计算方法。其一是根据质量算：蛋白质技术手册(汪家政)上说有一种工式：柱直径=(m/10cm)1/3其中m是蛋白的质量(mg),柱的长度=柱直径30，但这个柱直径 的计算公式我没看明白，用不上；其二是根据上样体积算：如果上样量是1ml，按1%的柱床体积则需要100ml树脂，直径1.5-1.6，长度50-60，但如果按2-3%的柱床体积则只需要30-50ml树脂，这样柱参数的变化又极大。您通常是怎样计算的?(具体到我所要分离的蛋白上样量是1ml,包含杂蛋白的总质量是4mg)
3．100ml树脂和50ml树脂对样本的稀释度是不是2:1?
1.G100刚性不好,容易因为压力,盐变化而体积改变,实在没有办法也只能用这个,但是你要保持恒定的流速,,盐或缓冲液的浓度,这样才能保证有很好的分离效果,说明书我想不好找，但是它和所有的sephadex处理是一样的。
2，处理量对于凝胶过滤一般是按体积算，通常上样量是柱床体积的5%左右应该，如果很接近，也可以降低到2%，你的1ml样，1.6x60cm的足够了。
3。一般稀释至少在2以上。
87) 还有个小问题，是不是G后面的数字越大，就刚性越差，越容易受外因素影响？
是的,G后面的数字越大，就刚性越差，越不耐压和盐溶液。
88) 我表达的是带有GST的融合蛋白，醇化后需用凝血酶切割，我想问一下这个凝血酶与临床上用的凝血酶一样吗?
是一样的，但是用于酶切的要求的纯度更高。
89) 在做WB，因为是血清标本，含有较多的白蛋白，可能影响我的实验结果。我请问过ptglab楼主，他推荐我来这儿问一问。请问高手有什么方法吗？哪一种比较简单经济？蓝色琼脂糖凝胶可以分离吗？
用蓝色琼脂糖凝胶就可以去除，我觉得很快也很特异，样品直接穿过柱子白蛋白就可以去掉90%以上，你pM你的邮件地址给我，我给你一份相关的材料，我们这里就有这个填料。
90) 凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析上样时，对样品目的蛋白浓度的要求是不是一样的？样品浓度一般要求在多大范围内？
凝胶过滤处理样品量主要是受体积的影响大，浓度相对要小一些，上样量在床体积5%左右，如果是除盐可以上到20%左右。
其他的主要是上样的浓度，一般就在5-10mg/ml填料，具体的情况得看填料的载量和使用说明。
91) 我问的意思 是在纯化过程中，如果蛋白酶抑制剂去掉了，而该蛋白酶还未去掉，我担心此蛋白酶还会消化我的目的蛋白，请问我说得有没有道理？有没有必要考虑？
你可以用抗体做WB检测你的纯化的蛋白，如果确实有酶解的现象，那你可以在纯化过程中你的缓冲液里加一些抑制剂，然后再做对比，我觉得你考虑得很周到，这个也是值得注意的问题，但是纯化的过程时间不长，一般没有必要这么做，但是有的蛋白有降解的现象，那就加试试。
92) 离子交换层析、亲和层析上样时样品的蛋白浓度可以达到5-10mg/ml？我觉得浓度是不是太大？
抱歉，没有说清楚，我的意思是填料的载量大多在这个范围，所以上样的多少由填料对你的目标蛋白的载量有关，也和填料的性质有关，一般的上样量可以按5-10mg/ml填料的量来上，至于浓度高到5-10mg/ml的样品也没有什么关系，因为其中真正你的目标蛋白不一定很高，所以其实这样的浓度也没有关系，具体的量和浓度还是要经过实验才知道。
93) 破碎菌体,加pBS缓冲液,目标蛋白就可以容于pBS缓冲液了吗？我的蛋白是包涵体。
那你就得用8M的脲或6M的盐酸胍溶解包涵体，然后复性再纯化了，用普通的缓冲液是溶解不了你的目标蛋白的，你的蛋白再破碎后的沉淀里，不在上清中。
94) 你好，我最近做纯化，遇上了两个问题，第一是使用sephrose fast flow做初纯，因为胶不够，我就将一年前使用过的旧胶（放在冰箱里）加入在正在使用的胶里面，出现了怪现象，整个胶变成了絮状， 沉不实，我一看，旧胶里面是有很多絮状物（不是其它东西，也是胶）漂在上面，下面沉淀的是胶，我立即加入了2M的NaCL，这时分层了，絮状物在上面，下面是胶，我于是除去了上面的东西，把下面的胶加上水清洗了三次，又用pH5.0的NaAC
处理了三次，完了，又变回当初的絮状态了，象稳定的絮状胶体一样，真不知到底怎么回事（也就是说加盐它就能沉，加水就絮状胶体），我的胶是不是不能用了？
另外，我做亲和，目的蛋白下面有两条带怎么都去不掉，我的蛋白是4聚体，是不是做SDS－page将它 解离了？我打算做native看看，但是高效液相结果显示很纯的，只是主峰后面有个类似拖尾的小峰，不知道是不是没有分离开，想请你帮我指点一二，另外能不能介绍下亲和方面的资料，非常感谢
你的旧填料是怎么保存的呢,是在20%的乙醇中的吗,你可以把你的填料在抽滤漏斗上去清洗,先用水洗,然后再用0.5MNaOH洗三次,再用20%乙醇洗,70%乙醇洗,水洗,这样你再取出胶在水中混悬看看,应该就好了,如果不好,那就没有办法了,但是一般这么处理应该没有问题.
亲和你用的是什么方法呢,什么填料,HPLC又是用什么柱子呢,是反相吗,我觉得你得先说清楚这样才好分析.
95) chromatography兄,很感谢你的帮助,我这里没有抽滤漏斗,请问那里可以买?贵吗? 我明天用你说得办法处理几次,看看有没有办法解决,如果没有抽滤漏斗,是不是有什莫替代品那?
亲和我使用的是sephrose cl 6B,配基是酶的底物,我的酶是有4个亚基的聚合体,共同存在时才有活性,那两条杂蛋白带在SDS-PAGE中位于主带的下面,洗脱采用底物类似物等pH浓度梯度洗脱,奇怪的是高浓度洗脱纯度较高,一般可以去掉其中的一条杂蛋白,但是另外较小的那条基本很难去除,有杂蛋白存在时酶活往往降低的好快,请chromatography兄帮我分析分析原因,很感激.
这样的砂心漏斗试剂公司就有，不贵，一套也就300来元，没有抽滤还没有别的好代替了，也可以用中间夹膜的漏斗。
至于你说的两条带，那按理你用底物类似物洗脱或pH洗脱会不会有非特异吸附呢，你平衡用什么条件，洗脱呢，你用什么活化的填料，我觉得非特异吸附的情况是存在的，你可以改变洗脱的方式，通常这些非特异吸附是离子交换作用，你可以可以在平衡液里增加点盐，这样可以去除这样的吸附，此外你目标蛋白会不会降解，这样有小分子还一样被吸附，你可以通过抗体做WB看看，如果是这样，那只能在纯化过程中加一些酶的抑制剂来避免。
我能想到的就是这两种情况了。
我是用的硼氢化钠和氢氧化钠活化的，然后加入偶联剂过夜，最后加入配基，采用pH7.5的5mM磷酸氢二钠缓冲液平衡，洗脱是等PH条件下进行的，只不过改变了洗脱剂的浓度，从最大浓度洗脱的结果看，往往就少了其中一条带，你的解释我会认真思考的，亲和中存在离子吸附，是不是目标蛋白和杂蛋白的等电点很接近造成的？平衡液中加点盐，主要起什么作用？一般加多少？使用什么盐好那？如果是我的蛋白解离，这样的杂蛋白有没有什么别的方法洗掉（除了加酶的抑制剂）？
你其实还是没有说清楚你活化的方法，看你的意思好象是环氧活化的方法，不知道你是怎么偶联的，如果你觉得是秘密，那也没有关系，只是你不说我很难判断是不是有非特异吸附，总之要是氨基和羧基缩合的方法，难免有离子交换作用，溴化氰也是这样的，而如果是环氧活化的方法，那么就没有离子交换的非特异吸附，至于盐的浓度可以加0.2-0.5M也足够了，如果是因为降解，那也许用这样亲和的方法就得把条件摸更细致点，如果不行，那可以看凝胶过滤能不能分开，即使不是降解，你也可以考虑凝胶过滤，而从你反映的情况好象杂质是个酶，加点抑制剂看看吧。
真的谢谢你无私帮助，我来到这个公司之前，他们就 已经使用这种方法了『硼氢化钠和氢氧化钠活化的，然后加入偶联剂过夜，最后加入配基』，我也不知道为什么，和经典的环氧等方法不一样，我们偶联剂用的是10个C，培基是带氨基的，硼氢化钠应该是还原剂的，基质是sepharose cl－6B，具体对这方面我不是很了解。我想最近作个native，和SDS对照一下，看看是不是降解，此外，这两条杂带从离子交换的时候它就一直存在的。
我就把胶放在柱子里，加上碱洗了三次，上面的水直接吸走，然后水洗，在加浓盐洗了两次，上面就漂浮着一层悬浮物，我小心再把它从上面吸走，之后在水里面好像就很好了，显微镜下我仔细看，与新胶没什么区别，谢谢你的帮助哦，我只是没有砂心漏斗，没法子试试而已。活化的方法是什么？我自己都不清楚.
96) 1、我们用CM52大量纯化某蛋白，经常会碰到介质裂缝，不知什么原因？
2、离子交换层析时柱高/直径的值有很高要求吗？如果为5/7会对分离有很大影响吗？用PB或ABS平衡时你们一般用多少柱床体积？
3、我们用5KD超滤浓缩后蛋白的损失很大，能否帮忙分析一下原因（PALL 的超滤器）？
那也许是因为有气泡,累积到一定地步后就穿过介质所以裂缝,你流速不能太快,而且缓冲液脱气,这样就应该好了.
2.一般离子交换没有必要算什么高/直径比，一般用的短粗柱子，亲和和疏水也都是这样的就可以，没有刻意要求，5/7应该影响也不大，当然如果你走线形梯度洗脱，也适当把这个比值增加点，如果走阶段洗脱就没有关系。
3。超滤膜本身的面积不小，这样也会吸附蛋白，特别是处理的量比较小的情况损失会很明显，如果量大，那损失会小的，此外如果蛋白不耐剪切力，那么用这样的方法浓缩也要特别小心，因为失活会很明显的。
97) 我做的是原核表达蛋白质，目的蛋白是一个GST-融合蛋白，现在通过SDS-PAGE电泳发现目的条带已经表达出来了，正在做纯化，但是过柱纯化后发现还有其他的几条带，应该只有目的条带的，我就按照分子克隆上说的在过柱前加了点triton-100,但再做电泳发现杂带还有几条，但目的条带却不见了，
1.为什么目的条带不见了？
2、下一步应该怎么办呢？
如果你的有一些别的杂带，那么你可以在清洗的时候多洗几个床体积，此外可以用还原谷胱甘肽做阶段洗脱，你试试，此外加大上样的流速，缩短作用时间，在你的平衡缓冲液中加点盐减少非特异吸附，你的带不见了，可能是
triton-100干扰结合，所以不能用，你用吐温也试试看，因为这个纯化特异性是比较高的，除非你的蛋白有降解现象，你可以用抗体做WB检测看看是不是都是你的目标蛋白，总之修改的方案就是我说的这几个，摸索一下吧。
此外可以选择作用力更弱点的填料。这样特意性更好。
98) 手头有碱性磷酸酶的资料吗？能否告诉我它的详细结构 我想提纯 谢谢拉
最好还可以告诉我想关的提纯方法！它存在于细胞壁与膜之间,大概80K（四聚体）、32KD（二聚体）,它耐高温80度仍然保持活性（在有镁离子存在的情况下）,最适PH8.0
我现在已粗步提取下步想层析, 你看该选择什么材料填柱
蛋白没有什么详细的结构吧，至于纯化它既然是碱性的蛋白，那你可以直接用阳离子柱子做粗步纯化，此外既然它能耐受80度，那你这样处理，大多的杂蛋白就沉淀了被去除，再上离子交换就应该有不错的效果。
填料可以选择CM琼脂糖凝胶和SP琼脂糖凝胶。
99) 前几天我提取了一种菊科植物的蛋白，用的是tris—Hcl缓冲液，然后用100%丙酮沉淀蛋白，结果蛋白中含有色素杂质，属水溶性，颜色很深，请教高手，如何除去色素干扰，纯化蛋白？另外我也查了一些资料，说可能是花色素，于是我在100%丙酮沉淀后，加了一步0.1%甲醇，但是并没有显著的效果。
你说的花色素就是黄酮类的花青素吗，它有很强的亲水性，所以丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了，你试试吧。
100) 用PB（pH6.8）或ABS(pH4.0)平衡时你们一般用多少柱床体积？10X够了吗？
一般也就3-5个床体积吧，离子交换需要平衡体积大点也，10X足够了
101) 有个关于胰岛素精纯化的问题想向你请教，我已取得95%纯度样品。但杂质大于1%，进一步纯化，用什么柱子，具体操作又怎样做呢，谢谢赐教。
我知道，我好象回复过，你用反相硅胶10um的柱子1.0X25cm或者2.2X25cm的柱子做制备，这样可以达到99%以上的纯度，别的方法很难做到你需要的纯度，此外胰岛素也可以用等电点沉淀的办法去掉一些杂质。
HPLC制备你可以参考相关的文献，其实也就是甲醇水或者乙腈水含三氟乙酸，先是低浓度吸附，然后提高浓度洗脱，详细的条件和你做反相纯化是一样的，只是HPLC的分离效果更好。
102) 请问怎样可以查到protein的PI值？，多谢了先！
已知的蛋白当然是查资料,未知的如果知道序列的话,可以用软件,你在论坛中搜索吧,有不少帖子的.
103) 谢了chromatography兄，也就是必需用小颗粒的硅胶填料了。
是的,需要用HPLC做制备,或者你优化的你工艺,看能不能提高纯度.
104) chromatography兄:
非常感谢回复，我手里也有一个GST融合表达的项目，经纯化后，用EK酶切时，出问题了。
目的蛋白是12KD左右，PI约PH9.5。用PH8.0，0.1M NACL条件酶切时，反应液发混，全部沉淀，切出的蛋白（约12KD）经尿素溶解，透析后，PH6.0不能挂上CM柱。用PH8.0，2mM CaCl2条件酶切时,也有发混，但目的蛋白有14KD左右，PH6.0可以挂上CM柱。不知是不是酶切条件有问题？
另外，chromatography兄，有化学破菌及EK酶切相关文献吗？给我发一份好吗，E-mail:zhangxstc@yahoo.com.cn
别客气,有沉淀也许是蛋白在那样的pH下溶解度不好,或者因为缓冲液的原因,挂不住会不会是没有切开,所以挂不柱.最好用电泳看看切的效果如何.
至于破碎我不很清楚,酶切你可以参考下面的东西:
http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins
105) 我想用DEAE纤维素来做填料
我的粗提酶液蛋白含量大约为7mg/ml我该选择哪个型号的DEAE呢？
DEAE纤维素要是同一家公司的差别不大,最常用的也就是DEAE纤维素 DE-52,其实我觉得你还是选择DEAE琼脂糖凝胶,流速也快,好用,没有什么必要一定用纤维素,何况价格也不便宜.你做的是什么酶呢.
106) 我想请问一下您在装柱（尤其是分子筛柱子）是否是按照填料的说明正向装呢，还是反向装？
我两种方法都试过的，但是只有一次是正向装完后，检测效价为30，000。请问装柱过程中除了填料和水要脱气和填料要一次性的倒入外，还有没有其他要注意的。最好能给我一个Protocol。谢谢！
另外，还有一个问题，我有一个90kD的融合蛋白（连GST），用GST的亲和柱纯化后总是有50多kD和20左右的杂蛋白。我用Sephacryl－S100能去掉它们吗？或者您可以给我一个更好的建议
1，我不明白，当然是正向装了，反向怎么装呢，其实装柱子只要均匀就可以，我几乎没测定过柱效，也没有Protocol，因为一般装的都没有问题，只要注意你说的几个问题就可以。
2。至于纯化的杂带你用抗体做WB看是不是降解的物质呢，你可以优化你纯化的条件，在平衡液体中提高盐的浓度，这样可以降低非特异吸附，这样再做做看，此外你可以用5mM,10mM.20mM还原谷胱甘肽阶段洗脱看看有什么结果，我觉得你先优化完如果没有纯化好，再用凝胶过滤吧，你可以选择sephadex G75或者是Superdex G-75，这样你的目标蛋白在外水体积中出来，后面的杂质在内水体积中，这样效果会更好点，如果用前面的S100不会比后面的两个填料效果好的。
107)
108) chromatography 大哥
我做的是碱性磷酸酶,大约32KD,我现在只做到硫酸氨盐析粗提,想进步纯化,你那有没有层析方面的资料,（比如材料的选择原则、洗脱液的选择、操作等方面）
这个蛋白硫酸铵沉淀后你可以直接用疏水,要不就透析,然后上阳离子交换的柱子,这样纯化不知道能到多少纯度,此外可以用亲和的办法,我看到的是把物质偶联到琼脂糖凝胶上做亲和,例如对氨基苯磷酸.洗脱用磷酸盐竞争洗脱就可以,这是比较好的方法.我给你发一份填料选择指南吧,也许会有的有点用处,此外把我见到亲和的文献发给你一篇
chromatography 大哥, 谢谢你拉, 资料我收到了, 我先看看还有问题在找你帮忙了,定向合成化学配基亲和层析纯化碱性磷酸酶, 新型染料配基对碱性磷酸酶的亲和纯化 是什么格式的我这解压缩后打不开了
文件是zip格式的,有winzip这个软件就可以打开了,应该很常见的.
109) chromatography 辛苦
我想纯化碱性蛋白酶, 具体方法设计如下:
65%硫酸胺沉淀,透析袋.
但是我的蛋白酶蛋白含量不损失是严重,不知道还有什么好的方法浓缩.
下一步纯化方法DEAE50, G200两种填料
不知道注意什么?谢谢
别客气,我不太清楚你说的但是我的蛋白酶蛋白含量不损失是严重,是什么意思,是损失严重吗,按理透析不应该有太大损失的,你可以用缓冲液把透析袋里面洗几次,这样能降低你的损失.其实上离子交换,不需要浓缩,直接上就
