蛋白纯化经验指南

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1）我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60%左右。

洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。

既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了。

我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3～5%的PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。

还有注意缓冲液PH值，看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。

2）请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶？

亲和的填料合成过20来种，你是希望用它来纯化某种脱氢酶吗，我看FMN可偶联的有限，倒是FAD有活泼的氨基好偶联，何况它们几乎是同一个辅酶，你是不是考虑把FAD连上去。

当然FMN的结构上也有个仲胺，可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上，而溴化氰活化或别的活化的介质都不大好，因此我觉得这个没有什么问题。

此外如果是以FMN为辅酶的，那我还可以建议你试试蓝色琼脂糖凝胶，因为它的配基的结构和FMN的三个环很相似，它能纯化不少脱氢酶和激酶。如果它可以你就不需要合成填料了，有现成的。

我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等。

但是如果是小分子的配基最好选择有3～10碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择自己适合的活化介质。

不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。

我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定，配基脱落少。

我觉得是不错的选择。包涵体的蛋白复性做得不多，但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法，他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术，那些时髦但不一定好用，常用的有透析复性，稀释复性，包括国外的专家也这么说。

我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行，关键要经常改变条件。层析复性很时髦，但是真正能用的不很多，我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同，所以关键要多看文献，多琢磨自己蛋白的特性，多尝试。