【原创】taq酶表达的一些个人经验
丁香园论坛
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最近做了taq酶的表达和纯化，将优化的实验流程和一点心得贴上来，希望对大家有帮助，更希望得到批评和指正
TaqDNA聚合酶表达载体的构建与提取纯化
1 .背景
重组TaqDNA聚合酶基因及表达载体插入重组Taq DNA聚合酶基因的pET-28a表达质粒，该质粒是由美国Novagen公司推出的能在大肠杆菌中高效表达的一种质粒载体。该质粒在克隆位点前有1个T7启动子，在T7启动子前有1个6×His-Tag coding序列，是T7的增强子，多克隆位点上有NcoI—Xhol11个酶切位点，载体上还有1个卡那霉素(Kan)的筛选标记。重组的Taq DNA聚合酶基因通过NdeI和Xhol双酶切克隆在表达质粒pET-28a多克隆位点上。
宿主菌为BL21(DE3)。菌株，即宿主菌BL21经噬菌体DE3溶源化后，DE3的lacUV5强启动子及位于其下游的T7 RNA聚合酶基因被整合到宿主菌的基因组DNA中。宿主菌在非代谢性乳糖类似物IPTG的诱导作用下能产生大量的T7RNA聚合酶，而T7RNA聚合酶能特异性地识别Pet-28a表达载体中的T7启动子序列，从而高效地表达目的重组蛋白。由于IPTG不会被宿主菌利用，因此向培养液中加入少量的IPTG 就能lacUV5强启动子产生持久的诱导作用。
2.材料与方法
1）.Taq DNA聚合酶表达载体构建
Nde1,Sal1双酶切通过pcr引进此双酶切位点taq酶基因，经过T4连接酶连接，将长度为2496bp的 taq聚合酶基因，插入同样双酶切的PET28a载体中。
2）.工程菌的转化
通过热击转化的方法，将连接产物转化BL21(DE3)表达菌株，通过菌落pcr,提取质粒酶切鉴定确认taq酶基因已经确实插入PET28a载体，送表达菌株测序验证。
3） .Taq DNA聚合酶基因的诱导表达
取已鉴定的阳性克隆，转接20ml含卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养，活化转化细胞。活化后，再取2mL培养液，转接到200 mL含卡那霉素的新鲜LB液体培养基，37℃、150 r／mim振荡培养3.5 h左右，至OD值=1.0时，加入表达诱导剂 (IPTG)，至终浓度1．0mmol／L，继续在37℃ ,150 r／min条件下振荡培养，诱导表达，诱导8小时后制备。（转接量、诱导起始时间。诱导用IPTG浓度、诱导时间已经经过系统优化）
4）.10000g/4℃/5min收集菌体，用50ml缓冲液A（20mM Tris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0）洗涤，10000g/4℃/3min，20ml缓冲液A重悬，4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分钟，加入DTT使终浓度为1mM,加入吐温-20使体积百分比为0.5%，75℃水浴45分钟，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即粗蛋白。上清中加入硫酸铵（4M的母液PH8.0）使其终浓度为1.6M，室温磁力搅拌器搅拌30分钟，12000g/室温/20分钟，用缓冲液B（20mM Tris-HCL,100mM KCl,0.5 mM EDTA,1 mMDTT,0.5℅吐温-20, 0.5℅NP-40,50℅甘油，PH8.0）重悬，酶液用缓冲液 B 4℃透析过夜。
5）.步骤4所得到的酶液即可用于检测实验，为了得到更纯的酶，粗蛋白经中速滤纸过滤后过Q sepharose FF,收集穿透液，再利用工程菌表达的6His作为纯化标记。上清(补足NaCl至终浓度为0.5M)流过已螯合Ni的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液（20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0, 5mM咪唑）平衡；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液（20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/30mM咪唑）依次洗涤；最后用洗脱液（20mM Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑）洗脱目的蛋白（SDS-PAGE检测蛋白纯度可达到85%以上）。含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液即步骤4中的缓冲液B。（也可以将洗脱下来的酶液用2M终浓度硫酸铵沉淀后离心，沉淀用酶保存缓冲液溶解，对检测实验没有影响）
反应缓冲液中的镁离子浓度可以根据具体实验需要进行调整
3.检测
纯化后的酶十倍稀释，荧光定量pcr检测活性
SDS-PAGE检测纯度。
4.总结与心得
1）.实验前的准备工作是实验成功的基石，广义的讲：这包括实验大方向的确定、原始文献阅读、基因序列的查找比对、基础工作的准备、每一步实验的分析总结。做好每一步实验的科学分析可以避免后续实验的失败还可以给自己每一小步都成功的感觉，做研发，需要给自己信心。
2）.做好预实验，也就是在实验中做好阳性对照和阴性对照，这有助于我们实验结果的分析。举个例子：做转化时，我们加上质粒转化验证感受态没有问题，加上感受态细胞转化抗生素平板 验证感受态没有被污染，这样，无论是什么样的转化结果（包括平板筛选结果）都可以得到很好的分析。
3）.用实验结果证明实验方法的成功与否，在蛋白纯化过程中，特别是在过阴离子柱或者阳离子柱时，凭空想象的离子浓度和PH值是不可取的，只有通过线性的离子浓度和PH值摸索纯化条件、数次重复对比实验，用真实的实验结果来确定所使用的实验条件。
4）.认真原始阅读文献，尽量用最符合生物科学的方法来解决问题，在实验过程中可以参照文献的实验方法，但一切用实验结果说话。
TaqDNA聚合酶表达载体的构建与提取纯化
1 .背景
重组TaqDNA聚合酶基因及表达载体插入重组Taq DNA聚合酶基因的pET-28a表达质粒，该质粒是由美国Novagen公司推出的能在大肠杆菌中高效表达的一种质粒载体。该质粒在克隆位点前有1个T7启动子，在T7启动子前有1个6×His-Tag coding序列，是T7的增强子，多克隆位点上有NcoI—Xhol11个酶切位点，载体上还有1个卡那霉素(Kan)的筛选标记。重组的Taq DNA聚合酶基因通过NdeI和Xhol双酶切克隆在表达质粒pET-28a多克隆位点上。
宿主菌为BL21(DE3)。菌株，即宿主菌BL21经噬菌体DE3溶源化后，DE3的lacUV5强启动子及位于其下游的T7 RNA聚合酶基因被整合到宿主菌的基因组DNA中。宿主菌在非代谢性乳糖类似物IPTG的诱导作用下能产生大量的T7RNA聚合酶，而T7RNA聚合酶能特异性地识别Pet-28a表达载体中的T7启动子序列，从而高效地表达目的重组蛋白。由于IPTG不会被宿主菌利用，因此向培养液中加入少量的IPTG 就能lacUV5强启动子产生持久的诱导作用。
2.材料与方法
1）.Taq DNA聚合酶表达载体构建
Nde1,Sal1双酶切通过pcr引进此双酶切位点taq酶基因，经过T4连接酶连接，将长度为2496bp的 taq聚合酶基因，插入同样双酶切的PET28a载体中。
2）.工程菌的转化
通过热击转化的方法，将连接产物转化BL21(DE3)表达菌株，通过菌落pcr,提取质粒酶切鉴定确认taq酶基因已经确实插入PET28a载体，送表达菌株测序验证。
3） .Taq DNA聚合酶基因的诱导表达
取已鉴定的阳性克隆，转接20ml含卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养，活化转化细胞。活化后，再取2mL培养液，转接到200 mL含卡那霉素的新鲜LB液体培养基，37℃、150 r／mim振荡培养3.5 h左右，至OD值=1.0时，加入表达诱导剂 (IPTG)，至终浓度1．0mmol／L，继续在37℃ ,150 r／min条件下振荡培养，诱导表达，诱导8小时后制备。（转接量、诱导起始时间。诱导用IPTG浓度、诱导时间已经经过系统优化）
4）.10000g/4℃/5min收集菌体，用50ml缓冲液A（20mM Tris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0）洗涤，10000g/4℃/3min，20ml缓冲液A重悬，4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分钟，加入DTT使终浓度为1mM,加入吐温-20使体积百分比为0.5%，75℃水浴45分钟，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即粗蛋白。上清中加入硫酸铵（4M的母液PH8.0）使其终浓度为1.6M，室温磁力搅拌器搅拌30分钟，12000g/室温/20分钟，用缓冲液B（20mM Tris-HCL,100mM KCl,0.5 mM EDTA,1 mMDTT,0.5℅吐温-20, 0.5℅NP-40,50℅甘油，PH8.0）重悬，酶液用缓冲液 B 4℃透析过夜。
5）.步骤4所得到的酶液即可用于检测实验，为了得到更纯的酶，粗蛋白经中速滤纸过滤后过Q sepharose FF,收集穿透液，再利用工程菌表达的6His作为纯化标记。上清(补足NaCl至终浓度为0.5M)流过已螯合Ni的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液（20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0, 5mM咪唑）平衡；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液（20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/30mM咪唑）依次洗涤；最后用洗脱液（20mM Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑）洗脱目的蛋白（SDS-PAGE检测蛋白纯度可达到85%以上）。含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液即步骤4中的缓冲液B。（也可以将洗脱下来的酶液用2M终浓度硫酸铵沉淀后离心，沉淀用酶保存缓冲液溶解，对检测实验没有影响）
反应缓冲液中的镁离子浓度可以根据具体实验需要进行调整
3.检测
纯化后的酶十倍稀释，荧光定量pcr检测活性
SDS-PAGE检测纯度。
4.总结与心得
1）.实验前的准备工作是实验成功的基石，广义的讲：这包括实验大方向的确定、原始文献阅读、基因序列的查找比对、基础工作的准备、每一步实验的分析总结。做好每一步实验的科学分析可以避免后续实验的失败还可以给自己每一小步都成功的感觉，做研发，需要给自己信心。
2）.做好预实验，也就是在实验中做好阳性对照和阴性对照，这有助于我们实验结果的分析。举个例子：做转化时，我们加上质粒转化验证感受态没有问题，加上感受态细胞转化抗生素平板 验证感受态没有被污染，这样，无论是什么样的转化结果（包括平板筛选结果）都可以得到很好的分析。
3）.用实验结果证明实验方法的成功与否，在蛋白纯化过程中，特别是在过阴离子柱或者阳离子柱时，凭空想象的离子浓度和PH值是不可取的，只有通过线性的离子浓度和PH值摸索纯化条件、数次重复对比实验，用真实的实验结果来确定所使用的实验条件。
4）.认真原始阅读文献，尽量用最符合生物科学的方法来解决问题，在实验过程中可以参照文献的实验方法，但一切用实验结果说话。
