【原创】非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大鼠海马组织蛋白

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Nondenature PAGE）主要是根据蛋白质分子的电荷性质、电荷多少和分子的大小来进行蛋白质分离。虽然它的分辨率不高，但它不像变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）那样使蛋白质变性，电泳后的蛋白质保持其生物活性，可以进行进一步的蛋白质分子结构与功能的测定.
1 材料
1.1设备 低温台式离心机（德国Beckman公司），高速台式离心机 TGL-16C（上海安亭科学仪器厂），DYY-10型三恒电泳仪（北京六一仪器厂），V16-夹心式垂直电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂），TY-80S脱色摇床（南京新校园生物技术研究所），PHS-3C数字式PH计（上海理达仪器厂），752紫外光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂），捷达801系列凝胶分析系统（江苏省捷达科技发展有限公司）
1.2 试剂
抑蛋白酶肽（aprotinin），亮抑蛋白酶肽（leupeptin），苯甲基磺酰氟（PMSF），二硫苏糖醇（DTT），钒酸钠（Na3VO4）等试剂购自Sigma公司，丙烯酰胺（acrylaminde,Acr），N,N亚甲基甲叉双丙烯酰胺（N,N Methylene Bisacrylaminde,Bis），过硫酸铵（Ammonium Persulfate,AP），四甲基乙二胺（TEMED），三羟甲基氨基甲烷（hydroxymethyl aminomethane,TRIS），考马斯亮兰R250（Coomassie Brilliant Blue R250），乙二胺四乙酸二钠（EDTA）等试剂进口分装，购自上海实生细胞生物技术有限公司
1.3 溶液配制
1.3.1样品提取液[3]：0.15mol/L NaCl，0.005mol/L EDTA，10mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2，10ug/ml aprotinin，0.5ug/ml leupeptin，3mmol/L PMSF，3mmol/L DTT，1mmol/L（Na3VO4），10 mmol/L Tris，PH7.5，现用现配。
1.3.2：30%丙烯酰胺单体贮存液：29.2g Acr，0.8g Bis，加水至100ml，过滤后棕色瓶内4℃保存
1.3.3样品缓冲液：0.1 mol/L Tris-HCl，10%甘油，0.0025%溴酚兰，PH6.8
1.3.4分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl， PH8.6、PH8.8、PH9.0（4×）
1.3.5浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl，PH6.8（8×）
1.3.6正极缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl， PH8.6、PH8.8、PH9.0（4×）
1.3.7负极缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L硼酸，PH8.5（10×）
1.3.8染色液：0.25%考马斯亮兰R250，50%甲醇，10%乙酸
1.3.9脱色液：30%甲醇，10%乙酸

2 方法
2.1蛋白提取
取成年SD大鼠，体重200~250g，断头处死，剥取海马称重，按1：10加入样品提取液，在冰浴中匀浆30分钟，然后4℃低温离心，12000rpm/min，10分钟后取上清，转移到另一个EP管中同样条件下离心30分钟。取上清分装后放-70℃保存待用。
2.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
按参考文献[4]方法并加以改进，采用带有循环水的V16-夹心式垂直电泳槽，不连续性的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。制备10%分离胶，水封静置50min，，在胶面与水之间出现清晰界面，即表示聚合已完成，轻轻吸去水，制备4%浓缩胶，插上梳子，静置1小时，拔出梳子，形成清晰的胶孔。取组织蛋白提取液，按1：4加入样品缓冲液，混匀，每孔15ul上样。倒入正负极电泳缓冲液，稳压150V电泳约1小时，溴酚兰到达分离胶与浓缩胶的界面时改变电压，稳压400V电泳45min，切断电源，
2.3 结果保存
小心剥下凝胶，室温下考马斯亮兰染色2小时，转移到脱色液中脱色，更换脱色液直至背景无色透明，凝胶分析系统拍照分析。