首次独立做western之真实感受~~~~~并请高手指教

前段时间在别人实验室学做western，做了若干次，感觉很容易呀！当然了，别人那试剂都是现成的，技术也成熟，每次都有结果呀！
然后回自己实验室来也学着别人的样开始搞。
我们这是个新的实验室，什么都没有啊，只有仪器，我买瓶瓶罐罐啊、试剂啊，然后刷刷洗洗，配各种溶液～～～～～～溶液真是多啊，我配了3天才完全配好！特别是调pH太耗时间！

开始做了！

做胶：别人实验室是用琼脂粉封底，我记得他们是5％，我自己一配，怎么这么稠啊(加热中）！完全搅不动，吸管都堵了！重新试，发现2％很好。照他们实验室的配方配好分离胶、积聚胶，一切顺利！

上样：上样前要让蛋白变性吧！他们实验室是超声，很好用，我这里没有超声，就煮吧。我把样品取了30ul在EP管里，放在100度水浴了10min，拿出来一看，只剩底下一点，都变成蒸汽凝结在管壁上了，又想离心把那些离下来，结果离心后发现有很多白色沉淀，于是我取上清加上样缓冲液上样。这里请教一下：1. 煮是必要的吗？我在提蛋白过程中超声过的。2. 为什么有沉淀？是什么成分？会不会是变性蛋白的沉淀？3. 上样缓冲液是煮前加还是煮后加好？

电泳：EC-250电源，他们那里电泳用恒流45-50mA，我这机器一样，但总不能保持恒流，一会恒流一会恒压的，这是怎么回事呀？反正电压80-100v，电流36-5mA波动。跑的非常慢，在积聚胶里花了1个小时，但线压的不是很细（0.75mm胶，上25ul），分离胶里花了半个小时左右。marker分的很清楚（预染的）。

转膜：EC-140 mini blot，这是个半干转的把！别人那边是湿转的，那这边只能自己摸索了。我按说明书先调恒压15v，但一启动就出错。后来改调恒流120mA，才好了！请教一下，电源有什么讲究吗？什么时候恒流恒压？我转了45分钟拿出来看，marker很清楚上去了！这是不是说明转成功了？
我用的NC膜，PS：别人那里NC膜一面光一面糙，他们说光的是正面要对着胶。但我买的NC膜两面一个样，后来又看见这里有人说nc膜正反都可，所以就这样转了。是不是真的正反都可以？

然后我用丽春红染膜看看有没有蛋白，但发现什么都没有！所以我怀疑煮的时候把它们煮掉了，会不会？还是因为丽春红不敏感？又拿考马斯R染胶，还是一片空白，这是因为本来就没有蛋白，还是蛋白已经转到膜上了呢？

不敢确定蛋白有没有，没有往下做了。各位师兄师姐请多多指教啊！万分感激！

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