【原创】尿嘧啶糖苷酶的表达与纯化
丁香园
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尿嘧啶糖苷酶的表达与纯化
做完taq酶的表达与纯化接着就做ung酶的表达与纯化，虽然刚刚做完taq酶的表达，但还是花了两个星期才做好ung酶的表达与纯化，把实验中的心得写出来，希望对大家有所帮助。
1：蛋白表达的实验前准备，确认原材料的来源与实验用水的洁净度，认真的配好每一种试剂，设计好实验方案。
2：上NCBI查找基因序列，确认ung酶基因在大肠杆菌K12菌株基因组的58.4min。总长度为690bp，所表达蛋白大小为25.69K道尔顿。
相关网址：
http://ecoli.naist.jp/GB6/info.jsp?id=JW2564&pager.offset=0
http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP/bng/170163.html
3：设计引物取目的基因
所用引物为：F:5-gactgcatatggcta acg aat taa ctt ggc atg-3 5’加NdeⅠ酶切位点
R:5-ctggtcgactta ctc act ctc tgc cgg taa tac t-3 5’加SalⅠ酶切位点
经验：在提取K12基因组时，我专门购买了大肠杆菌基因组提取试剂盒，花了500个银子，实际上根本不必买，在取目的基因时只要用适量的菌液就好。（当然，因实验而异，对基因组纯度要求高的实验还是需要提取试剂盒）
4：回收高保真酶扩增的PCR产物，NdeⅠ，SalⅠ双酶切，上同样用NdeⅠ，SalⅠ双酶切的PET28载体（需要SAP处理），转化BL21(DE3)表达菌株。由于刚刚购买的NdeⅠ，SalⅠ活性很低，因此在表达载体构建时消耗了大量时间，当确认感受态和转化方法没有问题，转化结果表现为：（1）表达载体没有经过SAP处理时，平板有很多单菌落，菌落PCR呈阳性，而酶切呈阴性（只要是K12株来源的大肠杆菌，或者是旁系，只要用但菌落做模板就能扩增出UNG酶基因，因此做本实验根本不需要购买基因组提取试剂盒）
（2）表达载体经过SAP处理时，转化平板没有单菌落时。可以考虑购买的酶活性出问题。
得到的教训是在做表达载体构建时，做酶活性考核的对照实验是重要的。
5：表达与纯化(直接用taq酶的提取方案，只是所用操作要求低温，试剂需要冰上预冷)
（1）取已鉴定的阳性克隆，转接20ml含卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养，活化转化细胞。活化后，再取2mL培养液，转接到200 mL含卡那霉素的新鲜LB液体培养基，37℃、150 r／mim振荡培养3.5 h左右，至OD值=1.0时，加入表达诱导剂 (IPTG)，至终浓度1．0mmol／L，继续在37℃ ,150 r／min条件下振荡培养，诱导表达，诱导3小时后收集菌体。
（2）10000g/4℃/5min收集菌体，用50ml缓冲液A（20mM Tris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0）洗涤，10000g/4℃/3min，20ml缓冲液A重悬，4mg/ml终浓度溶菌酶4℃处理30分钟，加入DTT使终浓度为1mM,加入吐温-20使体积百分比为0.5%，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即粗蛋白。
（3）粗蛋白经中速滤纸过滤后，利用工程菌表达的6His作为纯化标记。上清(补足NaCl至终浓度为0.5M)流过已螯合Ni的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液（20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0, 5mM咪唑）平衡；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液（20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/30mM咪唑）依次洗涤；最后用洗脱液（20mM Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, XmM咪唑）洗脱目的蛋白,取最高的收集峰收集（SDS-PAGE检测蛋白纯度可达到90%以上）。含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液即步骤4中的缓冲液B。为减少UNG酶中的DNA酶和RNA酶含量，做两次脱盐处理，用过量纯化的UNG酶与质粒/RNA 37℃16小时，电泳检测条带没有发生变化。
6：制备含有dUTP的PCR产物，用荧光定量pcr检测UNG酶活性。
7：做线性荧光定量pcr实验，做dUTP取代dTTP的缓冲液实验，实验结果为： dUTP终浓度为0.5mM，镁离子浓度调高0.5 mM后，反应体系的敏感度和曲线效率已经和全部用dTTPs的反应体系一致。
做完taq酶的表达与纯化接着就做ung酶的表达与纯化，虽然刚刚做完taq酶的表达，但还是花了两个星期才做好ung酶的表达与纯化，把实验中的心得写出来，希望对大家有所帮助。
1：蛋白表达的实验前准备，确认原材料的来源与实验用水的洁净度，认真的配好每一种试剂，设计好实验方案。
2：上NCBI查找基因序列，确认ung酶基因在大肠杆菌K12菌株基因组的58.4min。总长度为690bp，所表达蛋白大小为25.69K道尔顿。
相关网址：
http://ecoli.naist.jp/GB6/info.jsp?id=JW2564&pager.offset=0
http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP/bng/170163.html
3：设计引物取目的基因
所用引物为：F:5-gactgcatatggcta acg aat taa ctt ggc atg-3 5’加NdeⅠ酶切位点
R:5-ctggtcgactta ctc act ctc tgc cgg taa tac t-3 5’加SalⅠ酶切位点
经验：在提取K12基因组时，我专门购买了大肠杆菌基因组提取试剂盒，花了500个银子，实际上根本不必买，在取目的基因时只要用适量的菌液就好。（当然，因实验而异，对基因组纯度要求高的实验还是需要提取试剂盒）
4：回收高保真酶扩增的PCR产物，NdeⅠ，SalⅠ双酶切，上同样用NdeⅠ，SalⅠ双酶切的PET28载体（需要SAP处理），转化BL21(DE3)表达菌株。由于刚刚购买的NdeⅠ，SalⅠ活性很低，因此在表达载体构建时消耗了大量时间，当确认感受态和转化方法没有问题，转化结果表现为：（1）表达载体没有经过SAP处理时，平板有很多单菌落，菌落PCR呈阳性，而酶切呈阴性（只要是K12株来源的大肠杆菌，或者是旁系，只要用但菌落做模板就能扩增出UNG酶基因，因此做本实验根本不需要购买基因组提取试剂盒）
（2）表达载体经过SAP处理时，转化平板没有单菌落时。可以考虑购买的酶活性出问题。
得到的教训是在做表达载体构建时，做酶活性考核的对照实验是重要的。
5：表达与纯化(直接用taq酶的提取方案，只是所用操作要求低温，试剂需要冰上预冷)
（1）取已鉴定的阳性克隆，转接20ml含卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养，活化转化细胞。活化后，再取2mL培养液，转接到200 mL含卡那霉素的新鲜LB液体培养基，37℃、150 r／mim振荡培养3.5 h左右，至OD值=1.0时，加入表达诱导剂 (IPTG)，至终浓度1．0mmol／L，继续在37℃ ,150 r／min条件下振荡培养，诱导表达，诱导3小时后收集菌体。
（2）10000g/4℃/5min收集菌体，用50ml缓冲液A（20mM Tris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0）洗涤，10000g/4℃/3min，20ml缓冲液A重悬，4mg/ml终浓度溶菌酶4℃处理30分钟，加入DTT使终浓度为1mM,加入吐温-20使体积百分比为0.5%，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即粗蛋白。
（3）粗蛋白经中速滤纸过滤后，利用工程菌表达的6His作为纯化标记。上清(补足NaCl至终浓度为0.5M)流过已螯合Ni的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液（20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0, 5mM咪唑）平衡；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液（20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/30mM咪唑）依次洗涤；最后用洗脱液（20mM Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, XmM咪唑）洗脱目的蛋白,取最高的收集峰收集（SDS-PAGE检测蛋白纯度可达到90%以上）。含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液即步骤4中的缓冲液B。为减少UNG酶中的DNA酶和RNA酶含量，做两次脱盐处理，用过量纯化的UNG酶与质粒/RNA 37℃16小时，电泳检测条带没有发生变化。
6：制备含有dUTP的PCR产物，用荧光定量pcr检测UNG酶活性。
7：做线性荧光定量pcr实验，做dUTP取代dTTP的缓冲液实验，实验结果为： dUTP终浓度为0.5mM，镁离子浓度调高0.5 mM后，反应体系的敏感度和曲线效率已经和全部用dTTPs的反应体系一致。
