提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

酵母遗传学方法5:酵母β-半乳糖苷酶的测定

互联网

2504

 

酵母 β -半乳糖苷酶的测定

 

1)  粗提取物测定

 

1. 在适当温度下(通常 30 ℃),用适当培养液将 5ml 细胞培养物培养到浓度为 1 × 107 2 × 107 细胞 /ml 。如果自主复制质粒的杂合基因表达,可使用一种适当培养基对存在质粒的菌株进行筛选。

2. 在冰上冷却细胞,离心收集。注意:以下步骤保持细胞在冰上。

3. 弃上清液,将细胞悬浮于 250 μ l 裂解缓冲液中,然后置- 20 ℃冻结,以备的第二天测定。以下步骤均在 1.5ml 离心管中进行。

裂解缓冲液:

100 mmol/L Tris-HCl (pH8)

1 mmol/L 二硫苏糖醇

20 甘油

4. 若细胞冻结,可在冰上将其冻结。加玻珠恰好到液面下,再加 12.5 μ l PMSF 母液。

5. 以高速振荡混合 6 次,每次 15 秒,间歇时放在冰上。

6. 加入 250 μ l 的裂解缓冲液,用 1000 μ l 移液器插到离心管底部抽打使其充分混匀。

7. 离心 15 分钟澄清提取物。如果活性成分存在于颗粒状碎片中,则可用未澄清的上清液,而测定的混合物将在步骤 8 澄清。

8. 测定:

a.       10 100 μ l 抽提物到 0.9ml Z 缓冲液中,用裂解缓冲液定容至 1ml

Z 缓冲液:

16.1 g   Na2 HPO4 7H2 O

 

5.5 g    NaH2 PO4 H2 O

 

0.75 g   KCl

 

0.246 g  MgSO4 7H2 O

 

2.7 ml   β - 巯基乙醇

 

用蒸馏水定容至 1

 

pH 7.0 ,保存于 4

b.      28 ℃水浴中将混合物保温 5 分钟。

c.       加入 0.2ml 临硝基苯 - β -D 半乳吡喃糖苷( ONPG )母液,开始反应,注意准确时间,在 28 ℃下保温至混合物产生淡黄色。

d.      加入 0.5ml 碳酸钠母液终止反应,注意准确记录反应终止的时间,在 420nm 波长下测定光密度。

9. 采用 Bradford 1976 )染料结合测定法测定抽提物中的蛋白质浓度。

a.       用蒸馏水将 Bradford 试剂稀释 5 倍。用 Whatman540 号滤纸过滤稀释试剂。

b.      10 20 μ l 抽提物到 1ml 稀释试剂中,并混合。在 595nm 波长下测定形成的蓝色溶液。用一次性塑料比色杯以防止形成蓝膜影响测定结果。

c.       BSA 溶解于裂解缓冲液中,选用几个不同稀释度( 0.1 1mg/ml )制成标准曲线。

10.  根据下面公式计算抽提物的特异活性:

                            OD420 × 1.7            

 

0.0045 ×蛋白质×抽提物体积×时间

 

 

 

2)  通透细胞测定法

 

1. 按上述方法培养细胞,测定培养物的 OD600 ,当培养物细胞密度达 1 × 106 1 × 107 细胞 /ml ,同方法 1 离心收集细胞。

2. 弃上清液,将细胞悬浮于 1ml Z 缓冲液中。

3. 加入 3 滴氯仿和 2 0.1 SDS ,高速振荡 10 秒钟。

4. 28 ℃下预保温样品 5 分钟,同方法 1 加入 0.2ml ONPG 开始反应。

5. 当试管中的样品变为淡黄色时,加入 0.5ml 碳酸钠母液终止反应。注意在测定时所花时间,离心 10 分钟,弃细胞碎片和沉淀物。

6. 测定反应物 OD420 的光密度。

7. β - 半乳糖苷酶的活性单位为:

                               OD420                     

 

培养物 OD600 的光密度×测定体积×时间

 

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序