酵母遗传学方法5：酵母β－半乳糖苷酶的测定

酵母 β －半乳糖苷酶的测定

 

1）  粗提取物测定

 

1． 在适当温度下（通常 30 ℃），用适当培养液将 5ml 细胞培养物培养到浓度为 1 × 10⁷ ～ 2 × 10⁷ 细胞 /ml 。如果自主复制质粒的杂合基因表达，可使用一种适当培养基对存在质粒的菌株进行筛选。

2． 在冰上冷却细胞，离心收集。注意：以下步骤保持细胞在冰上。

3． 弃上清液，将细胞悬浮于 250 μ l 裂解缓冲液中，然后置－ 20 ℃冻结，以备的第二天测定。以下步骤均在 1.5ml 离心管中进行。

裂解缓冲液：

100 mmol/L Tris-HCl (pH8)

1 mmol/L 二硫苏糖醇

20 ％ 甘油

4． 若细胞冻结，可在冰上将其冻结。加玻珠恰好到液面下，再加 12.5 μ l PMSF 母液。

5． 以高速振荡混合 6 次，每次 15 秒，间歇时放在冰上。

6． 加入 250 μ l 的裂解缓冲液，用 1000 μ l 移液器插到离心管底部抽打使其充分混匀。

7． 离心 15 分钟澄清提取物。如果活性成分存在于颗粒状碎片中，则可用未澄清的上清液，而测定的混合物将在步骤 8 澄清。

8． 测定：

a.       加 10 ～ 100 μ l 抽提物到 0.9ml 的 Z 缓冲液中，用裂解缓冲液定容至 1ml 。

Z 缓冲液：

16.1 g   Na₂ HPO4 • 7H₂ O

 

5.5 g    NaH₂ PO4 • H₂ O

 

0.75 g   KCl

 

0.246 g  MgSO₄ • 7H₂ O

 

2.7 ml   β - 巯基乙醇

 

用蒸馏水定容至 1 升

 

调 pH 至 7.0 ，保存于 4 ℃

b.      在 28 ℃水浴中将混合物保温 5 分钟。

c.       加入 0.2ml 临硝基苯 - β -D 半乳吡喃糖苷（ ONPG ）母液，开始反应，注意准确时间，在 28 ℃下保温至混合物产生淡黄色。

d.      加入 0.5ml 碳酸钠母液终止反应，注意准确记录反应终止的时间，在 420nm 波长下测定光密度。

9． 采用 Bradford （ 1976 ）染料结合测定法测定抽提物中的蛋白质浓度。

a.       用蒸馏水将 Bradford 试剂稀释 5 倍。用 Whatman540 号滤纸过滤稀释试剂。

b.      加 10 ～ 20 μ l 抽提物到 1ml 稀释试剂中，并混合。在 595nm 波长下测定形成的蓝色溶液。用一次性塑料比色杯以防止形成蓝膜影响测定结果。

c.       将 BSA 溶解于裂解缓冲液中，选用几个不同稀释度（ 0.1 ～ 1mg/ml ）制成标准曲线。

10．  根据下面公式计算抽提物的特异活性：

                            OD₄₂₀ × 1.7            

 

0.0045 ×蛋白质×抽提物体积×时间

 

 

 

2）  通透细胞测定法

 

1． 按上述方法培养细胞，测定培养物的 OD₆₀₀ ，当培养物细胞密度达 1 × 10⁶ ～ 1 × 10⁷ 细胞 /ml ，同方法 1 离心收集细胞。

2． 弃上清液，将细胞悬浮于 1ml Z 缓冲液中。

3． 加入 3 滴氯仿和 2 滴 0.1 ％ SDS ，高速振荡 10 秒钟。

4． 28 ℃下预保温样品 5 分钟，同方法 1 加入 0.2ml ONPG 开始反应。

5． 当试管中的样品变为淡黄色时，加入 0.5ml 碳酸钠母液终止反应。注意在测定时所花时间，离心 10 分钟，弃细胞碎片和沉淀物。

6． 测定反应物 OD₄₂₀ 的光密度。

7． β - 半乳糖苷酶的活性单位为：

                               OD₄₂₀                     

 

培养物 OD₆₀₀ 的光密度×测定体积×时间