蛋白质转导—— 一个富有潜力的技术
丁香园
905
曾几何时，人们还沉浸在生物技术，特别是基因操作技术带来的喜悦之中。通过向细胞转移基因，尤其是让基因进入生物体或从生物体剔除基因的确改变了细胞和生物的表型。于是，人们试图利用这些技术制备生物产品，甚至治疗人类各种疾病。但是，自从1990年第一例人类基因治疗临床试验取得成功以来，这个领域总的进展是令人沮丧的。主要的问题还是技术方面的。人们很难将转基因引入细胞和机体，更难以将它们定向地导入特定类型的细胞。即使弄了进去，它们也不能长久滞留和受控表达。而且，它们还会产生许多令人失望的结果，比如，免疫原性和毒性。因此，科学家们设想干脆把一个全长的蛋白质引入细胞，让它直接发挥作用。可是，他们又面临另一道门槛：真核细胞的浆膜可以阻挡绝大部分的多肽和蛋白质。难道真的走投无路了吗？不，上帝虽然关上了门，却打开了一扇窗。
1、发现蛋白质转导域
1988年以来，人们发现了一种蛋白质功能域，它们能够引领其所承载的?#36135;物?#31359;过浆膜，并在细胞内积累，所以把它们称为蛋白质转导域（PTD）。现在已经发现三种PTD，分别来自果蝇的同源异形转录蛋白Antp、单纯疱疹病毒的结构蛋白VP22和人类I型免疫缺陷病毒的转录激活蛋白Tat。它们的出现为解决上述问题带来了新曙光。
2、PTD的组成
这三种蛋白质的PTD都有一段富含碱性氨基酸的短肽，长度在11-16个残基之间。其中精氨酸含量很高，精氨酸数量对这个功能域发挥作用是至关重要的。分析这些氨基酸序列发现，它们可以形成α-螺旋。由于α-螺旋的一面是带电荷的亲水残基，另一面是疏水残基。这样的结构就易于穿越细胞的膜组织。根据这些特点，人工设计了一些PTD。有的使α-螺旋的一面全部是能够使α-螺旋结构稳定的丙氨酸，而另一面全部是精氨酸。结果，它带领蛋白质进入细胞的能力提高了30倍。有的却由全9个L-型精氨酸组成，其工作能力也比天然的大20倍。更绝的是，用9个D-型的精氨酸组成的PTD，其能力比天然的大100倍以上！因此认为在促进分子进入细胞的过程中胍基比PTD分子的电荷和骨架更起作用。这些研究为PTD的广泛应用提供了重要的线索。
3、PTD的作用特点
将目的蛋白质与PTD融合，就可以委托PTD将蛋白质带入细胞中去了。PTD的这个作用有以下特点：1，速度快。一旦将细胞与融合蛋白一起培养，几乎立即就可以看到融合蛋白与细胞结合。在30分钟到6小时内可以见到融合蛋白在细胞内逐渐积累。18小时时，进入量达到最大值。24到48小时后，它们除了出现在内体和溶酶体外，还进入细胞核、核仁；2，温度适应性广。在4℃和37℃都可以进行；3，蛋白质进入的数量依赖于培养液中融合蛋白的浓度；4，融合蛋白几乎能够掺入100%的培养细胞。据认为每个细胞能够掺入107融合蛋白分子；5，不仅如此，如果将融合蛋白注射入动物的腹腔，在很短时间内，可以在几乎所有的组织和器官中看到融合蛋白。特别是通常非常难被外来分子突破的血脑屏障，也无法抵挡，任凭融合蛋白通过血管长驱直入到达脑部！6，能够被融合蛋白带入细胞和机体各处的分子品种繁多，它们包括小分子化学物质、肽、全长蛋白质（分子量从几千到几十万都可以）、反义核酸、直径40纳米的铁珠和直径200纳米的脂质体等等。能够同时具有这么多特点，并有如此强大穿透力的的运载体真是不多见的呀！
4、PTD的作用机制
说来难以置信，人们对于PTD介导穿越细胞膜的机制还是基本无知。从这些过程的迅速、耐低温、能力强和负载能力大等看来，只能说它们与受体、转运蛋白以及胞吞作用都没有关系。而从PTD一定是带有很强的正电荷来说，这些过程似乎分成两步，首先通过PTD的正电荷与细胞膜表面的负电荷相互作用，使融合蛋白依附在细胞膜上，再通过α-螺旋的穿越作用使融合蛋白进入细胞。
最近，终于获得一些可以解释这种作用的实验证据。有人证明精氨酸测链的胍基是转导至关重要的结构。比如，用氧取代胍基的氮，即用鸟氨酸取代PTD中的精氨酸，PTD就失去转导活性。可见，富含精氨酸的PTD正是通过胍基的电荷与细胞膜的负电荷相互作用而介导内化的。进一步研究又发现，细胞表面的硫酸肝素，一种蛋白聚糖在其中起着关键作用。如果损伤细胞生物合成硫酸肝素的能力，这些细胞也就不能让PTD融合蛋白进入其中。于是，我们终于明白了，因为硫酸肝素是一个非常广泛地存在于所有细胞表面的分子，所以PTD融合蛋白可以进入几乎所有类型的细胞。
但是不要太高兴得太早了，这些发现远远没有解决PTD何以具有神奇功能的疑问。比如，脂膜的疏水内涵对亲水蛋白质的掺入是巨大的障碍，可为什么PTD还可以介导很大的分子进入细胞呢？虽然细胞可以形成一些通道，让某些细菌毒素，如白喉毒素通过，但是这样的通道还不足以能让大到40纳米的铁珠通过呀。此外，看来PTD介导的转导不会破坏细胞膜的结构，因为它们在让融合蛋白穿越的同时并没有促进同时存在于培养液中的其他非PTD融合分子穿越。还有，在PTD介导治疗性分子穿越细胞膜时，也避免着不会让其他无关分子进入或离开细胞。这样精确的调节一定是还有更为巧妙的机制在控制的，有待我们研究阐明。
5、被PTD带入细胞的分子的命运
被PTD带入细胞的分子都还具有它们本来的活性。因此，它们在细胞内会各显其能，各尽其责。有的定向结合在相关靶点；有的在细胞内重新折叠，建成有活性的构象；有的在细胞内进行翻译后修饰，比如磷酸化和十四烷酸化；有的发生了大分子装配，如二聚、三聚或四聚；有的在细胞内到处游逛，进进出出细胞核和跑到细胞溶质膜上去；有的通过还原二硫键或裂解而与PTD分开；有的发生了分子改造；还有一些是通过非正统PTD带入的负载（药物或DNA），它们就被释放出来，各自发挥作用。可见，被带入细胞的分子基本上保留了它们各自原有的性质。在细胞内，它们该干什么，还干什么。这些特性使得这个技术特别具有吸引力。
6、蛋白质转导技术的应用前景
现在已经有包括几十种蛋白质在内的几百个分子被用PTD带入细胞或生物体。这张名单还在不断地延长着。特别是上面提到的被带入的分子仍然具有原来的性质，使这个技术能够在许多方面发挥作用。
在蛋白质结构与功能研究和应用中，通过将信号转导分子引入细胞，观察它们对细胞内信号过程的作用，有助于了解信号传递的机制。而将癌基因的抑制蛋白引入肿瘤细胞，能够进一步了解细胞癌变的分子机理，以找到在分子水平治疗肿瘤的方法。同样，将基因调节因子、转录调节因子等引入细胞，可以更深入地揭示细胞过程的分子机制。
看来将DNA送入细胞，让它表达，以研究基因产物的治疗或其他生物学作用这样的方法即将过时。因为基因的送入非常麻烦，效率很低，基因表达调节很困难，效率也低。即使用病毒送入基因，也只有30-50%的效率而已。可是，如果用PTD将目的蛋白送入细胞，依赖于融合蛋白的浓度，效率可以达到100%。注射入机体后，几乎100%细胞和组织，甚至脑部也可以被这样的蛋白质转导。所以，为什么不采用更新的，更有生命力的技术呢？
除了蛋白质之外，任何分子都可以被PTD带入细胞和机体。特别是可以用这个技术帮助难以被吸收的药物穿越组织屏障。许多药物因为难以穿越皮肤或黏膜，口服效果极差，只能通过静脉注射给予病人，例如环孢霉素A就是这样。但是，如果将环孢霉素A与PTD结合，就可以有效地穿越人和小鼠的皮肤，治疗皮肤炎。类似的方法也增加了一些药物穿越肺泡膜和口服的有效性。这个方法对皮肤病和皮肤肿瘤治疗都是有用的。
能够被PTD运送的分子与分子本身大小无关，这个特性也使本技术具有很大的治疗潜力。在许多培养细胞和动物模型中，大至100000的蛋白质也能被送入细胞和动物的许多组织和器官。40纳米的超级顺磁铁纳米颗粒也可以被造血和神经祖细胞摄入，其量可达每个细胞10到30皮克之多。而且，摄入这样大的颗粒不会影响细胞的生活、分化和增殖的能力。有趣的是，将这种细胞注射入小鼠，用顺磁共振追踪其在体内的行踪，在24小时后还能从组织中回收这些细胞。
有些治疗用的分子有比较大的极性，难以穿越细胞的脂膜。于是用脂质体来运送它们。但是，脂质体进入细胞的效率很低，还常常被胞吞作用降解。最近，有人用PTD将200纳米的脂质体转导入细胞，并发现在1小时之后脂质体在细胞内还是完整的。这些结果对将DNA转导入细胞也是有参考意义的。
目前，比较多的文献报道还是在分子机制研究的水平上关注PTD，对它的应用研究报道还不多。看来，我们还是可以在这个领域发掘一番，找到适合于我们目标的方向和课题的。
1、发现蛋白质转导域
1988年以来，人们发现了一种蛋白质功能域，它们能够引领其所承载的?#36135;物?#31359;过浆膜，并在细胞内积累，所以把它们称为蛋白质转导域（PTD）。现在已经发现三种PTD，分别来自果蝇的同源异形转录蛋白Antp、单纯疱疹病毒的结构蛋白VP22和人类I型免疫缺陷病毒的转录激活蛋白Tat。它们的出现为解决上述问题带来了新曙光。
2、PTD的组成
这三种蛋白质的PTD都有一段富含碱性氨基酸的短肽，长度在11-16个残基之间。其中精氨酸含量很高，精氨酸数量对这个功能域发挥作用是至关重要的。分析这些氨基酸序列发现，它们可以形成α-螺旋。由于α-螺旋的一面是带电荷的亲水残基，另一面是疏水残基。这样的结构就易于穿越细胞的膜组织。根据这些特点，人工设计了一些PTD。有的使α-螺旋的一面全部是能够使α-螺旋结构稳定的丙氨酸，而另一面全部是精氨酸。结果，它带领蛋白质进入细胞的能力提高了30倍。有的却由全9个L-型精氨酸组成，其工作能力也比天然的大20倍。更绝的是，用9个D-型的精氨酸组成的PTD，其能力比天然的大100倍以上！因此认为在促进分子进入细胞的过程中胍基比PTD分子的电荷和骨架更起作用。这些研究为PTD的广泛应用提供了重要的线索。
3、PTD的作用特点
将目的蛋白质与PTD融合，就可以委托PTD将蛋白质带入细胞中去了。PTD的这个作用有以下特点：1，速度快。一旦将细胞与融合蛋白一起培养，几乎立即就可以看到融合蛋白与细胞结合。在30分钟到6小时内可以见到融合蛋白在细胞内逐渐积累。18小时时，进入量达到最大值。24到48小时后，它们除了出现在内体和溶酶体外，还进入细胞核、核仁；2，温度适应性广。在4℃和37℃都可以进行；3，蛋白质进入的数量依赖于培养液中融合蛋白的浓度；4，融合蛋白几乎能够掺入100%的培养细胞。据认为每个细胞能够掺入107融合蛋白分子；5，不仅如此，如果将融合蛋白注射入动物的腹腔，在很短时间内，可以在几乎所有的组织和器官中看到融合蛋白。特别是通常非常难被外来分子突破的血脑屏障，也无法抵挡，任凭融合蛋白通过血管长驱直入到达脑部！6，能够被融合蛋白带入细胞和机体各处的分子品种繁多，它们包括小分子化学物质、肽、全长蛋白质（分子量从几千到几十万都可以）、反义核酸、直径40纳米的铁珠和直径200纳米的脂质体等等。能够同时具有这么多特点，并有如此强大穿透力的的运载体真是不多见的呀！
4、PTD的作用机制
说来难以置信，人们对于PTD介导穿越细胞膜的机制还是基本无知。从这些过程的迅速、耐低温、能力强和负载能力大等看来，只能说它们与受体、转运蛋白以及胞吞作用都没有关系。而从PTD一定是带有很强的正电荷来说，这些过程似乎分成两步，首先通过PTD的正电荷与细胞膜表面的负电荷相互作用，使融合蛋白依附在细胞膜上，再通过α-螺旋的穿越作用使融合蛋白进入细胞。
最近，终于获得一些可以解释这种作用的实验证据。有人证明精氨酸测链的胍基是转导至关重要的结构。比如，用氧取代胍基的氮，即用鸟氨酸取代PTD中的精氨酸，PTD就失去转导活性。可见，富含精氨酸的PTD正是通过胍基的电荷与细胞膜的负电荷相互作用而介导内化的。进一步研究又发现，细胞表面的硫酸肝素，一种蛋白聚糖在其中起着关键作用。如果损伤细胞生物合成硫酸肝素的能力，这些细胞也就不能让PTD融合蛋白进入其中。于是，我们终于明白了，因为硫酸肝素是一个非常广泛地存在于所有细胞表面的分子，所以PTD融合蛋白可以进入几乎所有类型的细胞。
但是不要太高兴得太早了，这些发现远远没有解决PTD何以具有神奇功能的疑问。比如，脂膜的疏水内涵对亲水蛋白质的掺入是巨大的障碍，可为什么PTD还可以介导很大的分子进入细胞呢？虽然细胞可以形成一些通道，让某些细菌毒素，如白喉毒素通过，但是这样的通道还不足以能让大到40纳米的铁珠通过呀。此外，看来PTD介导的转导不会破坏细胞膜的结构，因为它们在让融合蛋白穿越的同时并没有促进同时存在于培养液中的其他非PTD融合分子穿越。还有，在PTD介导治疗性分子穿越细胞膜时，也避免着不会让其他无关分子进入或离开细胞。这样精确的调节一定是还有更为巧妙的机制在控制的，有待我们研究阐明。
5、被PTD带入细胞的分子的命运
被PTD带入细胞的分子都还具有它们本来的活性。因此，它们在细胞内会各显其能，各尽其责。有的定向结合在相关靶点；有的在细胞内重新折叠，建成有活性的构象；有的在细胞内进行翻译后修饰，比如磷酸化和十四烷酸化；有的发生了大分子装配，如二聚、三聚或四聚；有的在细胞内到处游逛，进进出出细胞核和跑到细胞溶质膜上去；有的通过还原二硫键或裂解而与PTD分开；有的发生了分子改造；还有一些是通过非正统PTD带入的负载（药物或DNA），它们就被释放出来，各自发挥作用。可见，被带入细胞的分子基本上保留了它们各自原有的性质。在细胞内，它们该干什么，还干什么。这些特性使得这个技术特别具有吸引力。
6、蛋白质转导技术的应用前景
现在已经有包括几十种蛋白质在内的几百个分子被用PTD带入细胞或生物体。这张名单还在不断地延长着。特别是上面提到的被带入的分子仍然具有原来的性质，使这个技术能够在许多方面发挥作用。
在蛋白质结构与功能研究和应用中，通过将信号转导分子引入细胞，观察它们对细胞内信号过程的作用，有助于了解信号传递的机制。而将癌基因的抑制蛋白引入肿瘤细胞，能够进一步了解细胞癌变的分子机理，以找到在分子水平治疗肿瘤的方法。同样，将基因调节因子、转录调节因子等引入细胞，可以更深入地揭示细胞过程的分子机制。
看来将DNA送入细胞，让它表达，以研究基因产物的治疗或其他生物学作用这样的方法即将过时。因为基因的送入非常麻烦，效率很低，基因表达调节很困难，效率也低。即使用病毒送入基因，也只有30-50%的效率而已。可是，如果用PTD将目的蛋白送入细胞，依赖于融合蛋白的浓度，效率可以达到100%。注射入机体后，几乎100%细胞和组织，甚至脑部也可以被这样的蛋白质转导。所以，为什么不采用更新的，更有生命力的技术呢？
除了蛋白质之外，任何分子都可以被PTD带入细胞和机体。特别是可以用这个技术帮助难以被吸收的药物穿越组织屏障。许多药物因为难以穿越皮肤或黏膜，口服效果极差，只能通过静脉注射给予病人，例如环孢霉素A就是这样。但是，如果将环孢霉素A与PTD结合，就可以有效地穿越人和小鼠的皮肤，治疗皮肤炎。类似的方法也增加了一些药物穿越肺泡膜和口服的有效性。这个方法对皮肤病和皮肤肿瘤治疗都是有用的。
能够被PTD运送的分子与分子本身大小无关，这个特性也使本技术具有很大的治疗潜力。在许多培养细胞和动物模型中，大至100000的蛋白质也能被送入细胞和动物的许多组织和器官。40纳米的超级顺磁铁纳米颗粒也可以被造血和神经祖细胞摄入，其量可达每个细胞10到30皮克之多。而且，摄入这样大的颗粒不会影响细胞的生活、分化和增殖的能力。有趣的是，将这种细胞注射入小鼠，用顺磁共振追踪其在体内的行踪，在24小时后还能从组织中回收这些细胞。
有些治疗用的分子有比较大的极性，难以穿越细胞的脂膜。于是用脂质体来运送它们。但是，脂质体进入细胞的效率很低，还常常被胞吞作用降解。最近，有人用PTD将200纳米的脂质体转导入细胞，并发现在1小时之后脂质体在细胞内还是完整的。这些结果对将DNA转导入细胞也是有参考意义的。
目前，比较多的文献报道还是在分子机制研究的水平上关注PTD，对它的应用研究报道还不多。看来，我们还是可以在这个领域发掘一番，找到适合于我们目标的方向和课题的。
