基本方案

本实验用噬菌体P22对鼠伤寒沙门氏菌进行并发转导(共转导),供体细菌中的两个连锁基因可被导入受体细菌中,与受体细菌中的一个可选择表型的基因进行三点杂交分析,用以确定这三个基因的排列顺序。

若有三个基因,其野生型分别用A、B、C表示,相应的突变型基因分别记为a、b、c。若A、B、C三个基因的排列如图32-1所示,即B基因在A基因和C基因之间,供体基因型为aBC,受体基因型为Abc,经转导选择C表型。在C转导子中A和B两基因的组合有如下四种:①Ab,DNA链之间发生两次交换;②AB,同样是DNA链之间发生两次交换的结果;③aB,也是DNA链之间发生两次交换的结果;④ab,是DNA链之间发生四次交换的结果。根据四次交换少于二次交换这一原理,再检测ab型转导子出现的频率,如果ab型转导子频率很低,接近于0,则上述推测的基因排列顺序是正确的。同理,如果A基因在B基因和C基因之间,AB转导子频率接近于0;若C基因在A和B的中间,这四种类型转导子的频率都不可能接近于0。

(一)将TT12399的Mini-Tn10d-tet引入TT13976

1.挑取供体菌TT12399单菌落接种于5mlLB液的试管中,置37℃振荡培养过夜,取1ml过夜培养物加到5mlP22肉汤中,37℃振荡培养8～16h。经4000r/min离心10min,收集上清液即为TT12399的P22裂解液。

2.接种TT13976于LB培养液,37℃振荡培养过夜。

3.取0.1mlTT13976的过夜培养物和0.1ml适当稀释的P22裂解液进行混合,然后涂布在LB(Tet)平板上,置37℃培养过夜。

4.挑取在LB(Tet)平板上的单菌落进行分离纯化,选择不含噬菌体的菌株作为三点杂交的供体菌。

(二)三点杂交

1.按常规制备上述供体的P22裂解液。

2.接种受体菌TT10251于LB培养液中,30℃振荡培养过夜。

3.取0.1mlTT10251的过夜培养物和0.1ml适当稀释的供体菌株P22裂解液,混合后涂布在LB(Tet)平板上,置30℃培养过夜。

(三)转导子基因型的测定

1.在上述LB(Tet)平板上生长的菌落为四环素抗性转导子。用无菌牙签将这些菌落逐个挑取分别点种在LB平板上(挑200个菌落),置30℃培养过夜。

2.以上述平板菌落长出后作为母平板,将其分别影印在NCE(Man-Tet)和LB(Tet-Kan)平板上,置30℃培养24～48h。

3.对比观察NCE(Man-Tet)和LB(Tet-Kan)平板上菌落的生长情况。

4.记录四种表型组合KansMan^-,KansMan⁺,KanrMan^-和KanrMan⁺的转导子数,并计算各表型组合出现的百分比。

5.确定zxx1900::Tn10d-tet、add和pmi三个基因的排列顺序。

受体菌TT10251培养温度保持在30℃。因为MudA插入突变体pmi::MudA在37℃不稳定。

试剂补充说明：

LB培养液,LB固体培养基补加四环素(终浓度为20μg/ml)(以下简称LB/Tet),LB固体培养基补加四环素(终浓度为20μg/ml)和卡那霉素(终浓度为50μg/ml)(以下简称LB/Tet/Kan),NCE-甘露糖固体培养基(甘露糖浓度为0.5%,补加四环素终浓度为10μg/ml),肉汤培养基,NCE培养基(每1000ml 50×NCE含:KH₂PO₄ 197g,K₂HPO₄·H₂O 325.1g,Na(NH₄)HPO₄·H₂O 175g,H₂O 925ml)。

配制NCE培养液时,用蒸馏水将50×NCE稀释成1×NCE,每800ml 1×NCE培养液加1mol/L MgSO₄,再补加碳源。配制NCE固体培养基时,用蒸馏水将50×NCE稀释成2×NCE,并配制等体积的2.6%琼脂粉,分别灭菌后混合,补加MgSO₄、碳源和其他所需营养组分,倒平板。