【原创】半个多学期关于毕赤酵母的化学转化与表达的几点经验，并附上改进的简便廉价方法
丁香园
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一次认为最无望的化学转化，结果长出70多个转化子。分析原因，有以下几点不同于以往的做法：
我认为关键不同点是以下的2、3、4、6点，但没时间和精力去验证，希望大家给点指示。
1、 质粒酶切与乙醇沉淀等操作比平时长，都大于12h。
2、 乙醇37℃挥发3h，当时怕时间过长质粒降解了。
3、 热激之前的保温和热激温度都比平时高2-3℃，怀疑温度计坏了，歪打正着。以前有次转化长出40多个，温度比较恒定。这次温度又高又不恒定，由此可以排除温度是否恒定不是关键因素。
4、 做感受态时蒸馏水洗涤，由于不做转化有一段时间了，洗涤用水是平时的2倍。
5、 MD培养把108℃×35min错用成121℃×20min，结果MD中的葡萄糖有点焦化，颜色比平时偏深。但这次转化没受影响，感觉培养基不是关键因素，以前没加微量元素的MD板转化子也能生长很好。（第1次转化吸取PEG用200ul枪，应该用1000ul的大枪，吸取量不够，也长出10个转化子，感觉PEG的作用也不是关键因素）
6、 感受态不一样，转接之前的酵母菌菌密度合适，而且放置3-4天。放置1个week，转接转化，只长出3个转化子。以前转接之前的酵母菌摇菌超过16-18h，只长了1个转化子或没有转化子。接菌的单菌落小，那么转接之前的菌密度小，即使5%的接菌量，摇菌5h也达不到0.8-1.0。不过菌密度小不是非常影响转化效率，菌密度大过老反而颗粒无收。
YPD种子液转接无机培养基之前菌密度OD600不应该太大，比如OD600=28，否则诱导之前的OD600>100，可能由于菌活力不够不表达目的蛋白；但如果YPD的OD600没达到10-20，比如约6，转接后在无机培养基里经过48h，即诱导之前也能达到OD600约20。
但如果合并无机培养基诱导之前的菌液，再倾倒部分液体，从而提高菌密度，这样的菌没老化，不会引起蛋白不表达。最佳OD600=40-80。
摇瓶发酵期间污染的菌常常是红霉菌，在LiCl化学转化中有时转化子是红霉菌，我不敢要，放弃。个人认为补加甲醇等无菌操作酒精瓶口烧一下，反而更容易染菌，不如动作迅速。
附上化学转化和无机发酵操作步骤
附1：化学转化
1）准备感受态细胞
（1）25ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌16-18 hours；
（2）25ml YPD，接种百分之五，同时留1ml空白YPD（真馏水也行），30度 ，250rpm振荡培养～5hours至 A 600为 0. 8～1. 0（大约108细胞/ml）；
（3）1500rpm室温离心5min收获细胞，每份感受态需要(1.5ml酵母/1.5mlEP管)×4管，每次转化做2管感受态 , 用750ul灭菌水洗涤 , 1500rpm室温离心5min；
（4）每管菌体重悬于 30ul 100 mmol/L LiCl中 , 每4管并转移至 1管1. 5 mL离心管中 , 以 12 000 rpm室温离心 15 s, 弃 LiCl；
（5）将2管菌体各重悬于50ul 100 mmol/L LiCl中 ,即为感受态酵母细胞。
2） 转化
（1）将 1 mL 鲑精 DNA 2 mg/L 煮沸5 min, 迅速置冰上冷却；
（2）将感受态 GS115细胞以 12 000 rpmin离心 15 s, 弃上层 LiCl；
（3）按顺序依次加入 240μL的500 g/L PEG-3350、36μL的 1 mol/L LiCl、25μL鲑精 DNA及 50μL线性化质粒 DNA（5-10μg）, 在涡旋混合器中剧烈混匀 1 min,使细胞沉淀与加入的溶液充分混匀；
（4）于 30℃孵育 30 min。再于 42℃水浴中热击 20min（20-25min）后 , 以 8 000 rpmin（6000-8000rpm）离心10min收集细胞 , （轻柔地）重悬于 200ulYPD培养基中 , 于 30℃振荡培养；
（5）重悬后直接加20μL到MD板上，30℃培养 2～4 （或4～5d）d，至菌落直径1mm即可。
附2：摇瓶无机发酵，廉价简便
我认为关键不同点是以下的2、3、4、6点，但没时间和精力去验证，希望大家给点指示。
1、 质粒酶切与乙醇沉淀等操作比平时长，都大于12h。
2、 乙醇37℃挥发3h，当时怕时间过长质粒降解了。
3、 热激之前的保温和热激温度都比平时高2-3℃，怀疑温度计坏了，歪打正着。以前有次转化长出40多个，温度比较恒定。这次温度又高又不恒定，由此可以排除温度是否恒定不是关键因素。
4、 做感受态时蒸馏水洗涤，由于不做转化有一段时间了，洗涤用水是平时的2倍。
5、 MD培养把108℃×35min错用成121℃×20min，结果MD中的葡萄糖有点焦化，颜色比平时偏深。但这次转化没受影响，感觉培养基不是关键因素，以前没加微量元素的MD板转化子也能生长很好。（第1次转化吸取PEG用200ul枪，应该用1000ul的大枪，吸取量不够，也长出10个转化子，感觉PEG的作用也不是关键因素）
6、 感受态不一样，转接之前的酵母菌菌密度合适，而且放置3-4天。放置1个week，转接转化，只长出3个转化子。以前转接之前的酵母菌摇菌超过16-18h，只长了1个转化子或没有转化子。接菌的单菌落小，那么转接之前的菌密度小，即使5%的接菌量，摇菌5h也达不到0.8-1.0。不过菌密度小不是非常影响转化效率，菌密度大过老反而颗粒无收。
YPD种子液转接无机培养基之前菌密度OD600不应该太大，比如OD600=28，否则诱导之前的OD600>100，可能由于菌活力不够不表达目的蛋白；但如果YPD的OD600没达到10-20，比如约6，转接后在无机培养基里经过48h，即诱导之前也能达到OD600约20。
但如果合并无机培养基诱导之前的菌液，再倾倒部分液体，从而提高菌密度，这样的菌没老化，不会引起蛋白不表达。最佳OD600=40-80。
摇瓶发酵期间污染的菌常常是红霉菌，在LiCl化学转化中有时转化子是红霉菌，我不敢要，放弃。个人认为补加甲醇等无菌操作酒精瓶口烧一下，反而更容易染菌，不如动作迅速。
附上化学转化和无机发酵操作步骤
附1：化学转化
1）准备感受态细胞
（1）25ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌16-18 hours；
（2）25ml YPD，接种百分之五，同时留1ml空白YPD（真馏水也行），30度 ，250rpm振荡培养～5hours至 A 600为 0. 8～1. 0（大约108细胞/ml）；
（3）1500rpm室温离心5min收获细胞，每份感受态需要(1.5ml酵母/1.5mlEP管)×4管，每次转化做2管感受态 , 用750ul灭菌水洗涤 , 1500rpm室温离心5min；
（4）每管菌体重悬于 30ul 100 mmol/L LiCl中 , 每4管并转移至 1管1. 5 mL离心管中 , 以 12 000 rpm室温离心 15 s, 弃 LiCl；
（5）将2管菌体各重悬于50ul 100 mmol/L LiCl中 ,即为感受态酵母细胞。
2） 转化
（1）将 1 mL 鲑精 DNA 2 mg/L 煮沸5 min, 迅速置冰上冷却；
（2）将感受态 GS115细胞以 12 000 rpmin离心 15 s, 弃上层 LiCl；
（3）按顺序依次加入 240μL的500 g/L PEG-3350、36μL的 1 mol/L LiCl、25μL鲑精 DNA及 50μL线性化质粒 DNA（5-10μg）, 在涡旋混合器中剧烈混匀 1 min,使细胞沉淀与加入的溶液充分混匀；
（4）于 30℃孵育 30 min。再于 42℃水浴中热击 20min（20-25min）后 , 以 8 000 rpmin（6000-8000rpm）离心10min收集细胞 , （轻柔地）重悬于 200ulYPD培养基中 , 于 30℃振荡培养；
（5）重悬后直接加20μL到MD板上，30℃培养 2～4 （或4～5d）d，至菌落直径1mm即可。
附2：摇瓶无机发酵，廉价简便
