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【资源】蛋白组学资料——质谱

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1381
胶上酶切方法
1.  用1.5mm3切胶笔切下胶点,置于96孔板或1.5ml Appendorf试管中。
2.  用50ul双蒸水洗2次,每次10分钟(如用1.5ml试管, 则用500ul)。
3.  加考染胶色液(50mM NH4HCO3/CH3CN(1:1))50ul,超声脱色5分钟或37℃ 20分钟,吸干。(若为银染胶点,可以不脱色,也可以加15mM K3Fe(CN)6/50mM Na2S2O3轻摇至变为淡黄色透明,再用水反复洗至无色)。
4.  重复步骤3,至蓝色褪去。
5.  加CH3CN 50ul脱水至胶粒变白,真空抽干10分钟。
6.  加10mM DTT(25mM NH4HCO3)20ul,56℃水浴1小时。
7.  冷至室温,吸干,快速加50mM IAA(25mM NH4HCO3)20ul,置于暗室45min。
8.  依次用下列溶液进行超声或混悬清洗: 25mM NH4HCO3(2次)、25mM NH4HCO3+50%CH3CN(2次)、CH3CN(1次),每次10分钟。CH3CN 脱水至胶粒变白,真空抽干10分钟。
9.  将0.1ug/ul酶液用25mM NH4HCO3稀释10-20倍,每管加2-3ul,稍微离心一下,让酶液与胶粒充分接触,4℃放置30min 。待酶液被胶粒完全吸收,加25mM NH4HCO3至总体积10-15ul,37℃过夜。
10. 加入0.1%TFA或50%CH3CN +0.1%TFA终止反应,振荡混匀,离心收集酶解液,点靶。

注:1)每加一次溶液,都要旋涡振荡,胶粒要充分浸没在溶液中,进行下一步操作前把溶液吸走。2)如果胶粒大于1.5mm3,应把胶粒切成1.5mm3再脱色,使用各溶液的量也应相应增加。3)保持溶液和用具洁净,防止污染。

AnchorChip 点样须知

1.配基质溶液:0.4mg/ml HCCA in AT (ACN: 0.1%TFA=70:30).
2. 点样(二步法):取样品酶解液1 ul (考染)或3 ul (银染,分两次点样: 1.5 ul-> dry ->1.5 ul-> dry )点靶,晾干。
3.  点基质:取1ul基质点在晾干的样品上。
4.  点标准品:将4 pmol/ul的肽混合物标准品用基质溶液稀释200倍后,取1 ul点靶,晾干。
5.  除盐(标准品可不除盐):把1 ul 0.1%TFA 点在靶上,放20秒后再吸走 (如盐多,可重复两次)。

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