【资源】蛋白组学资料——质谱
丁香园
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胶上酶切方法
1． 用1.5mm3切胶笔切下胶点，置于96孔板或1.5ml Appendorf试管中。
2． 用50ul双蒸水洗2次，每次10分钟（如用1.5ml试管, 则用500ul）。
3． 加考染胶色液（50mM NH4HCO3/CH3CN(1:1)）50ul，超声脱色5分钟或37℃ 20分钟，吸干。（若为银染胶点，可以不脱色，也可以加15mM K3Fe(CN)6/50mM Na2S2O3轻摇至变为淡黄色透明，再用水反复洗至无色）。
4． 重复步骤３，至蓝色褪去。
5． 加CH3CN 50ul脱水至胶粒变白，真空抽干10分钟。
6． 加10mM DTT（25mM NH4HCO3）20ul，56℃水浴1小时。
7． 冷至室温，吸干，快速加50mM IAA（25mM NH4HCO3）20ul，置于暗室45min。
8． 依次用下列溶液进行超声或混悬清洗: 25mM NH4HCO3（2次）、25mM NH4HCO3+50%CH3CN（2次）、CH3CN(1次),每次10分钟。CH3CN 脱水至胶粒变白，真空抽干10分钟。
9． 将0.1ug/ul酶液用25mM NH4HCO3稀释10-20倍，每管加2-3ul，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30min 。待酶液被胶粒完全吸收，加25mM NH4HCO3至总体积10-15ul，37℃过夜。
10. 加入0.1%TFA或50%CH3CN +0.1%TFA终止反应，振荡混匀，离心收集酶解液，点靶。
注：1）每加一次溶液，都要旋涡振荡，胶粒要充分浸没在溶液中，进行下一步操作前把溶液吸走。2）如果胶粒大于1.5mm3，应把胶粒切成1.5mm3再脱色，使用各溶液的量也应相应增加。3）保持溶液和用具洁净，防止污染。
AnchorChip 点样须知
1．配基质溶液：0.4mg/ml HCCA in AT (ACN: 0.1%TFA=70:30).
2. 点样（二步法）：取样品酶解液1 ul (考染)或3 ul (银染,分两次点样: 1.5 ul-> dry ->1.5 ul-> dry )点靶，晾干。
3. 点基质：取1ul基质点在晾干的样品上。
4. 点标准品：将4 pmol/ul的肽混合物标准品用基质溶液稀释200倍后，取1 ul点靶，晾干。
5. 除盐(标准品可不除盐)：把1 ul 0.1%TFA 点在靶上,放20秒后再吸走 (如盐多，可重复两次)。
我为人人，人人为我，希望版主给个1分，谢谢
1． 用1.5mm3切胶笔切下胶点，置于96孔板或1.5ml Appendorf试管中。
2． 用50ul双蒸水洗2次，每次10分钟（如用1.5ml试管, 则用500ul）。
3． 加考染胶色液（50mM NH4HCO3/CH3CN(1:1)）50ul，超声脱色5分钟或37℃ 20分钟，吸干。（若为银染胶点，可以不脱色，也可以加15mM K3Fe(CN)6/50mM Na2S2O3轻摇至变为淡黄色透明，再用水反复洗至无色）。
4． 重复步骤３，至蓝色褪去。
5． 加CH3CN 50ul脱水至胶粒变白，真空抽干10分钟。
6． 加10mM DTT（25mM NH4HCO3）20ul，56℃水浴1小时。
7． 冷至室温，吸干，快速加50mM IAA（25mM NH4HCO3）20ul，置于暗室45min。
8． 依次用下列溶液进行超声或混悬清洗: 25mM NH4HCO3（2次）、25mM NH4HCO3+50%CH3CN（2次）、CH3CN(1次),每次10分钟。CH3CN 脱水至胶粒变白，真空抽干10分钟。
9． 将0.1ug/ul酶液用25mM NH4HCO3稀释10-20倍，每管加2-3ul，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30min 。待酶液被胶粒完全吸收，加25mM NH4HCO3至总体积10-15ul，37℃过夜。
10. 加入0.1%TFA或50%CH3CN +0.1%TFA终止反应，振荡混匀，离心收集酶解液，点靶。
注：1）每加一次溶液，都要旋涡振荡，胶粒要充分浸没在溶液中，进行下一步操作前把溶液吸走。2）如果胶粒大于1.5mm3，应把胶粒切成1.5mm3再脱色，使用各溶液的量也应相应增加。3）保持溶液和用具洁净，防止污染。
AnchorChip 点样须知
1．配基质溶液：0.4mg/ml HCCA in AT (ACN: 0.1%TFA=70:30).
2. 点样（二步法）：取样品酶解液1 ul (考染)或3 ul (银染,分两次点样: 1.5 ul-> dry ->1.5 ul-> dry )点靶，晾干。
3. 点基质：取1ul基质点在晾干的样品上。
4. 点标准品：将4 pmol/ul的肽混合物标准品用基质溶液稀释200倍后，取1 ul点靶，晾干。
5. 除盐(标准品可不除盐)：把1 ul 0.1%TFA 点在靶上,放20秒后再吸走 (如盐多，可重复两次)。
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