请教各位大侠。。。（有关膜蛋白提取的一些问题）
丁香园论坛
1691
2004-02-23 19:35 yxiangmind在资料区提到：
分离细胞膜蛋白的方法：
1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)
buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),
分离细胞膜蛋白的方法：
1）细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
2）加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
3)刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
4）溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min
5)收集水相留作分析
6）用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
7）按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
8）用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂
2）缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer)
3)buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
分离细胞膜蛋白的方法：
7M urea
2M thiourea
4%chaps
2.5%sb3-10
1000000个细胞，可用此 buffer 1ml。 冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速低温离心30min。
取上清-20保存。
请问yxiangmind和各位大侠，上述方法中用的各种试剂是哪些生产商提供？这三种方法哪种收集膜蛋白比较完全？还有其他收集膜蛋白的好方法吗？
分离细胞膜蛋白的方法：
1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)
buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),
分离细胞膜蛋白的方法：
1）细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
2）加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
3)刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
4）溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min
5)收集水相留作分析
6）用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
7）按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
8）用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂
2）缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer)
3)buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
分离细胞膜蛋白的方法：
7M urea
2M thiourea
4%chaps
2.5%sb3-10
1000000个细胞，可用此 buffer 1ml。 冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速低温离心30min。
取上清-20保存。
请问yxiangmind和各位大侠，上述方法中用的各种试剂是哪些生产商提供？这三种方法哪种收集膜蛋白比较完全？还有其他收集膜蛋白的好方法吗？
