【求助】蛋白提取问题

最近在做原代培养的神经细胞的凋亡研究。对于六孔板中蛋白提取有些疑问。药物处理后，总有一些细胞漂浮起来，估计就是凋亡或坏死细胞，直接吸弃培养基怕对凋亡相关蛋白检测有影响。如果细胞消化离心，又担心提取不够迅速使一些目的蛋白去磷酸化，比如MAPK信号通路蛋白。请问大家，应该怎么解决这个问题呢，有什么好的办法？

1. 我们也遇到过类似问题，但经过检测，我们发现培养基上清漂浮的细胞确实就是晚期凋亡或坏死细胞，这一部分细胞里面的凋亡相关蛋白，包括磷酸化蛋白，是明显改变的；
2. 我们是这么提取的，首先把上清培养基（含有漂浮的凋亡或坏死细胞）吸入离心管，然后1000 rpm在低温下快速离心5min左右，但是这样仍只能收集到相当少的细胞，因为离心过程中很多坏死细胞直接碎裂了，但是有些会出现沉淀，沉淀的细胞直接加入少量RIPA裂解液直接裂解提取蛋白（冰上，参考下面）；
3. 剩下的贴壁细胞则经冰PBS洗涤2遍后，添加RIPA全细胞裂解液，使用细胞刮将其刮下（这也在冰上低温操作，且裂解液中加入包括磷酸酶抑制剂等在内的cocktail等），这样再将两者混合，再去跑western blot问题就不大；
4. 我们还试过western blot发现，上清里面的细胞的磷酸化的蛋白活化程度明显没有贴壁的高，呵呵，不过可能与细胞类型有关，不好说。

希望对楼主有帮助，大家讨论，共同提高。

非常感谢ronaldo_zj !

我有个疑问，通常六孔板里加200 ul RIPA已经足够。按照您提供的方法，我感觉离心管底那么少的细胞也就加几十微升裂解液，这么少的量能否覆盖住离心管底并将细胞充分裂解，又如何从离心管里移出与贴壁细胞裂解液相混合呢？细节问题，能否麻烦您详细介绍一下？

我上次提取细胞是这么做的：实验室有个可以离心板子的离心机。因此，六孔板4℃，2000转/min，离心5min. 然后轻弃培养液，板孔未经PBS洗涤直接加200ul RIPA冰上裂解细胞。不知此种方法是否可行，有何不足之处？还请ronaldo_zj和各位战友多多指教！

1. 是这样的，这要看你细胞的量，如果用六孔板的话，那么细胞会相对少一点，这个时候我们往往加入80-100微升的RIPA（前提是一定要把离心剩下的上清彻底吸干，吸的时候一定要小心别把沉淀吸走，这个很容易吸到沉淀），然后剧烈震荡20s后，置于冰上10min，且10min内不间断震荡2-3次，再去离心（4度，14000rpm），取得上清；

2.对于贴壁的细胞，也类似，离心后取得上清，将两者混合即可；

3.您说的应该是水平离心机吧？这个固然好，因为这样省事，也很快，不过你未经PBS洗涤直接添加RIPA的话势必会影响到结果啊？特别是一些分泌型因子，磷酸化蛋白的话也会有影响，这个时候会出现假阳性啊？不知您觉得呢？

4. 或者可以这样，第一次离心离去培养基，然后再加PBS洗涤后水平离心两次，这样可能会好点，但是这样也会将时间拖的很长，我觉得这个很不利啊，我没有这样试过，因为反复的三次离心是否会影响到贴壁细胞内的磷酸化蛋白的状态？因为上清的细胞固然有磷酸化蛋白的存在，但更多的，或者更重要的是贴壁细胞的那部分，我觉得这部分是关键，所以如果离心三次的话是不是有点舍本逐末的感觉？呵呵，个人设想而已啊。

这个还得楼主自己摸索，不过我们是按照我说的那种方法做，结果还不错，呵呵，祝楼主好运。

ronaldo_zj战友，我按照您提供的方法提了一次蛋白，仍然感觉把漂浮细胞吸入离心管里裂解操作比较困难，首先，漂浮细胞离心后离心管里的上清很难弃尽；再次，加入很少量的裂解液，裂解离心后上清取出也比较困难。

因此，我决定下次这么做：首先把板子用水瓶离心机离心后，弃掉上清。每孔加1ml预冷PBS轻洗板孔两次，PBS转移入2mlEP管，即把漂浮细胞改为在EP管中裂解操作。这样既解决了不清洗的话血清对磷酸化蛋白测定的影响，又解决了离心管操作不方便的问题。不知您觉得如何？

抱歉，五一回家了，回复有点晚。呵呵。

可以两个孔并起来提蛋白，这样细胞就多了